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Temas:

Tcnicas histolgicas y tipos de coloracin.


Caractersticas generales del tejido epitelial.
Dra.: Geraldina Paredes Bottoni
Ponente: Jos Garay Llamccaya
Tejidos
Estudio, Tratado
Es la ciencia que estudia todo lo referente a los tejidos
orgnicos: su estructura microscpica, su desarrollo y sus
funciones. La Histologa se identifica a veces con lo que se ha
llamado anatoma microscpica.

A.-La tcnica a la parafina.
B.-Histoqumica - citoqumica.
C.-Inmunohistoqumica.
D.-Autorradigrafa.

A.-Tcnica a La Parafina

La tcnica a la parafina siempre se utiliza para preparar cortes de tejidos.
La tcnica incluye las siguientes fases

1.-Muestra de tejido.
2.-Fijacin.
3.-Deshidratacin.
4.-Aclaramiento.
5.-Inclusin.
6.-Corte.
7.-Tincin y montaje.
1.- MUESTRA DE TEJIDO
El procedimiento consiste en la extraccin de un fragmento de tejido,
ya sea de:

Necropsia.-Para histologa normal es necesario que se trate de un cadver fresco,
que no haya sido atacado por ninguna lesin, por lo menos el rgano que se quiere
estudiar.
Biopsia.-son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida con el objeto de
estudiarlos al microscopio y efectuar un diagnstico histopatolgico.
Piezas (rganos) Operada.-los tejidos que han sido extrados de las
intervenciones quirrgicas, generalmente tumores u rganos inflamados,
tambin pueden darnos material de investigacin pero, como en el caso anterior, slo
servirn para anatoma patolgica.
Necropsia Biopsia con agujas
Muestra de tejido de la corteza cerebral
2.-FIJACIN
Despus de obtener la muestra de un tejido, esta
debe ser colocada en una solucin fijadora, esto
para evitarla degeneracin post mortem y los
cambios que deforman la estructura de los tejidos y
clulas, tambin para endurecer los tejidos blandos.

Por lo comn se utiliza el formaldehdo al 4% en
solucin acuosa , amortiguada con un ph neutro
(formol).
Fijacin de la muestra
Cualidades de un fijador
Actuar con rapidez, matando y fijando
a las clulas antes de que aparezcan
los fenmenos agnicos o post-mortem
(autlisis, desintegracin, etc.).
Poseer alto poder de penetracin para
asegurar la fijacin correcta hasta en
las capas profundas de la pieza a fijar.
Conservar, en lo posible, los detalles
estructurales que presentaban in vivo.
Tipos/clases de fijadores:
a) Formol
b) Alcohol etlico absoluto o de 96%
c) cido smico al 1 2%
d) Bicromato de potasio al 3-5%.
3.-Deshidratacin
Las piezas al ser retiradas del fijador, o
despus de haberlas lavado, estn embebidas
en agua; impidiendo que sean penetradas por
la parafina. Por lo tanto, en primer lugar,
debemos deshidratar los tejidos
sumergindolos en lquidos anhidros, vidos
de agua. Para evitar alteraciones provocadas
por una deshidratacin brusca, se aconseja
proceder escalonadamente utilizando,
preferentemente, alcohol etlico de graduacin
creciente.
Deshidratacin en alcoholes sucesivos.
4.-Aclaramiento.
El alcohol no es un solvente de la
parafina, de tal forma que es necesario
sustituirlo por un xilol.
Se pasa el bloque deshidratado a
travs del xilol en cambios sucesivos,
hasta sustituir el alcohol por el xilol.
5.-Inclusin
A continuacin se sumerge el tejido en
parafina fundida, generalmente a 60 C. A
causa del calor el xilol o benzol se evaporan
y el espacio anteriormente ocupada por
ellos es ocupada ahora por la parafina.
Inmediatamente despus se coloca en un
molde rectangular con un poco de parafina
fundida, para que se solidifique.
5.-Inclusin
6.-Cortes
El bloque de parafina que contiene los
tejidos incluidos son cortados por navaja
de acero del micrtomo, obtenindose
generalmente cortes de 5 a 8
micrmetros.


Corte en micrtomo tipo Minot.
Consideraremos cuatro tipos de micrtomo:
el de deslizamiento
el tipo Minot
el de congelacin
el cristato o critomo
-Tipo deslizamiento: en este caso la pieza queda fija mientras la
cuchilla se desliza por unas guas especiales merced a un soporte al que
se sujeta la cuchilla con unos tornillos.
Tipo Minot: en este caso la cuchilla queda fija y es la pieza la que se
desliza sujeta a una platina, sta se desliza verticalmente cuando se
hace girar una manivela. Permite obtener cortes seriados en forma de
cinta.
Tipo congelacin: se parece al de deslizamiento, pero la cuchilla o
navaja, en lugar de deslizarse, gira sobre un eje. Por otra parte, el
aparato se caracteriza por tener un sistema de congelacin colocado
debajo de la platina que utiliza la expansin brusca del anhdrido
carbnico contenido en un cilindro con el cual se comunica.
- Cristato: consta de un micrtomo tipo Minot incluido en una cmara
de congelacin.

7.-Tincin y montaje
La laminilla se le pasa a travs del xilol parta eliminar la
parafina, despus por alcohol para eliminar el xilol y
finalmente por agua, el corte esta lista para la tincin.
Despus de teir el corte se hace pasar por una serie de
recipientes con alcohol hasta llegar al grado absoluto,
despus por xilol; por ultimo se le monta en una gota o dos
del medio de montaje disuelto en xilol. El montaje elimina la
difraccin no deseada de la luz, con cuidado se pone el
cubre objetos protector sobre el corte , para que cuando se
evapore el xilol el medio de montaje quede ntimamente
unido a la laminilla cubreobjetos y al porta objetos.

Montaje
montaje elimina la difraccin no deseada de la
luz, con cuidado se pone el cubre objetos
protector sobre el corte , para que cuando se
evapore el xilol el medio de montaje quede
ntimamente unido a la laminilla cubreobjetos y
al porta objetos.

Resumen
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B.-Histoqumica- citoqumica
El termino de histoqumica- citoqumica se utilizan
para denominar los mtodos que permiten
identificar y localizar diversas sustancias tanto en
corte histolgico como en las clulas en cultivo.
Para obtener este tipo de informacin se utiliza
fundamentalmente reacciones qumicas
especificas o bien en interacciones de afinidad
alta entre diversas molculas.

Tcnicas histoqumicas para la deteccin de hidratos de
carbono:

Tcnica de PAS. La reaccin de PAS (Acido Perydico - reactivo
de Schiff) es una de las ms utilizadas para detectar polisacridos
presentes en el glucgeno, en las secreciones mucosas, en las
membranas basales. Los cortes se tratan primero con el cido
perydico que reacciona con los azucares formando aldehdos.
Luego se coloca el reactivo de Schiff que se une a los aldehdos
formando un pigmento magenta insoluble.

Tcnica de azul alcin. El azul alcin tie de azul hidratos de
carbono asociados a grupos sulfato o carboxilos. Se utiliza para
detectar glicosaminoglicanos, glicoprotenas sulfatados o
carboxilados. Estos compuestos son muy comunes en algunas
secreciones glandulares y en la matriz extracelular.
El siguiente cuadro contiene tres imgenes del epitelio cilndrico
del intestino delgado obtenidas con MO a 1000x. La flecha negra
seala la regin ocupada con los grnulos de secrecin ubicada
en el polo apical de una clula glandular caliciforme.
Tcnica de H-E. El polo
apical aparece como
vaco. Nada nos dice
sobre la naturaleza
qumica del producto de
secrecin
Tcnica de PAS con hematoxilina.
Mediante esta tcnica
comprobamos la presencia de
hidratos de carbono en el material
a secretar. la flecha azul seala la
membrana basal.
Tcnica de azul alcian con
hematoxilina. Mediante esta
tcnica comprobamos que el
material secretorio contiene
hidratos de carbono sulfatados o
carboxilados.
Deteccin de lpidos:

Los lpidos se disuelven en los solventes orgnicos (alcohol, xilol) utilizados para la inclusin
en parafina, dejando espacios vacos en los preparados histolgicos. Sin embargo, pueden
preservarse si se realizan cortes de congelacin con el cristato. Para MO los lpidos
pueden detectarse utilizando colorantes INDIFERENTES que son ms solubles en los
lpidos que en las soluciones donde se disuelven para hacer el colorante (ej. el Sudan y el
rojo escarlata).

Tejido adiposo. H-E 400X.
A: espacio ocupado por los
lpidos antes de procesar la
muestra. Flecha, ncleo del
adipocito
Tejido adiposo procesado
mediante congelacin. Los
lpidos fueron teidos con
Sudan rojo. 400X
Inmunocitoqumica
Es una rama de la histoqumica.
Esta tcnica se basa en el hecho de que el organismo reacciona ante
sustancias proteica extraas (antgenos), elaborando sustancias
especificas ( los anticuerpos) que se combina con los antgenos y los
inactivan.
Corresponde a un grupo de tcnicas de inmunotincin que permiten
demostrar una variedad de antgenos presentes en las clulas o tejidos
utilizando anticuerpos marcados. Estas tcnicas se basan en la
capacidad de los anticuerpos de unirse especficamente a los
correspondientes antgenos. Esta reaccin es visible slo si el
anticuerpo est marcado con una sustancia que absorbe o emite luz o
produce coloracin.

Autorradiografa
La autoradiografa es una tcnica de deteccin de
molculas marcadas radiactivamente que emplea
emulsiones fotogrficas sensibles a la partcula
radiactiva o a la luz producida por una molcula
intermediaria. La emulsin que contiene plata es
sensible a la radiacin particulada (alfa, beta) o
electromagntica (radiacin gamma, luz, ...), de forma
que se precipita en forma de plata metlica. El
revelado de la emulsin revelar en forma de
precipitados oscuros la regin en la que se localizan
las protenas radiactivas.
Tipos de Coloracin
Colorantes: reciben esta denominacin las sustancias que
pueden conferir color a otros cuerpos.

Coloracin: es el proceso mediante el cual un cuerpo es
teido por una sustancia colorante, sin perder el color
cuando es lavado con el disolvente utilizado al preparar la
solucin colorante.
Clasificacin de los colorantes:
Segn su origen se clasifican en:

1.-COLORANTES NATURALES:
-Animales (carmn)
- Vegetales (hematoxilina, orcena, azafrn)

2.-COLORANTES ARTIFICIALES O SINTTICOS (COLORES DE ANILINA):
-cidos: sales cuya base es incolora y su cido es coloreado (eosina o eosinato
de sodio). Son colorantes citoplasmticos.
- Bsicos: sales cuya base es coloreada y el cido es incoloro (azul de metileno
o clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares.
- Neutros: sales en las que tanto el cido como la base son coloreados. Tien el
ncleo de un color y el citoplasma de otro.
- Indiferentes: no forman sales. Tien aquellas sustancias que tienen un poder
disolvente superior al del lquido que ha servido para preparar la solucin
colorante (Sudn lll, rojo escarlata).

Por otro lado, las coloraciones pueden ser:
- Ortocromticas: los tejidos adquieren un color igual al de la solucin colorante
empleada.
- Metacromticas: una sustancia o un componente celular se tie con un color
diferente al del colorante empleado.

Colorantes ms utilizados en histologa humana:

HEMATOXILINA:
-Es un colorante vegetal.
- Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Los
agentes oxidantes pueden ser: el aire (varios meses de
exposicin) u oxidantes artificiales (xido de mercurio,
permanganato de potasio, dicromato potsico, etc.)
- Es un colorante directo, pero en la prctica se lo utiliza en
forma de lacas hematoxilnicas (se utiliza alumbre de potasio o
de sodio como mordiente para preparar la solucin colorante),
comportndose en este caso como un colorante indirecto.

EOSINA:
- Es un colorante artificial (se trata de derivados
hidroxixantnicos halogenados con tres grupos arilo).
- Presenta autofluorescencia espontnea.
- Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohlicas.
LAMINA BASAL


Es una fina capa de matriz extracelular que separa el tejido epitelial y muchos
tipos de clulas, como las fibras musculares o las clulas adiposas, del tejido
conjuntivo. Suele confundirse con la membrana basal, pero en realidad forma
parte de ella junto a la lmina reticular.
Cuando aparece rodeando fibras musculares o adipositos se la denomina
lmina externa.
La lmina basal slo es observable con detalle a microscopio electrnico y est
compuesta por una matriz electrodensa de entre 50 y 100 nm que consta a su
vez de lmina lcida y lmina densa.
La lmina lcida: fija la membrana plasmtica a la lmina basal.
Posee glicoprotenas como la laminina y la fibronectina y proteoglicanos
como el separan sulfato.
La lmina densa: ms electrodensa presenta unos delgados y
pequeos filamentos de colgeno tipo IV.

Funcin:
Sostn del epitelio.
Filtracin molecular pasiva, deja pasar determinadas
molculas, lo que adquiere especial importancia en los
riones.
Comparte tejidos y filtro celular. Los linfocitos s pueden
atravesarla pero es capaz de retener la metstasis de
tumores invasores.
Adhesin celular.
Influye sobre la diferenciacin de las clulas y sobre la
reparacin de tejidos desde sus clulas madre.

Las flechas sealan la
membrana basal.
Bajo algunos epitelios la
membrana basal (B)
adquiere un gran desarrollo
Caractersticas generales de los tejidos
epiteliales

En los tejidos epiteliales,
las clulas estn
estrechamente unidas entre
s formando lminas. La
matriz extracelular es
escasa y se ubica por
debajo de las de clulas
epiteliales. Ella forma una
delgada capa llamada
lmina basal.

Asociacin del citoesqueleto
de cada clula, con la lmina
basal y con el citoesqueleto
de las clulas adyacentes.
Las clulas soportan las tensiones mecnicas, por medio de
resistentes filamentos proteicos que se entrecruzan, en el
citoplasma de cada clula epitelial, formando el
citoesqueleto. Para transmitir la tensin mecnica de una
clula a las siguientes, estos filamentos estn unidos a
protenas transmembrana ubicadas en sitios especializados
de la membrana celular. Estas protenas se asocian, en el
espacio intercelular, ya sea con protenas similares de la
membrana de las clulas adyacentes, o con protenas
propias de la lmina basal subyacente.

Los tejidos epiteliales limitan tanto las cavidades internas
como las superficies libres del cuerpo. La presencia de
uniones especializadas entre sus clulas permite a los
epitelios formar barreras para el movimiento de agua, solutos
o clulas, desde un compartimiento corporal a otro. Un
epitelio separa el lumen intestinal de los tejidos subyacentes;
y un epitelio separa a la pared intestinal de la cavidad
abdominal



Polaridad
Clula
polo basal
Polo apical
Lamina basal
Porcin libre de la clula
polaridad
Las diferentes partes de estas clulas presentan funcin
distintas.
La membrana plasmtica de las clulas epiteliales suelen
tener una composicin molecular diferente en sus polos.
Renovacin
1. Son estructuras dinmicas, cuyas clulas se
renuevan continuamente actividad mittica.
2. Las tasas de renovacin es variable:
Rpida tejido epitelial intestinal ( se sustituye
por completo c/semana).
Lenta: hgado y pncreas.
3. En los T.E. estratificado y T.E seudoestratificado la
mitosis tiene lugar en la capa basal de estos,
donde se localiza las clulas que originan estos
epitelios.
Especializacin de la superficie de la clula
epitelial
La superficie de las clulas epiteliales est muy
desarrollada para cumplir funciones especializadas:
La principal adaptacin es el aumentar la superficie, que
en diferente tipos celulares se logra mediante
microvellosidades, pliegues basolaterales y la placa de
membrana.
La necesidad de mover sustancias por la superficie se
logra gracias a las proyecciones mviles de la clula
denominada cilios ( participan en el transporte).

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