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IDENTIFICACIÓN DE LA INFECCIÓN POR

STREPTOCOCCUS INIAE EN DIFERENTES
ÓRGANOS DE TILAPIA ROJA (OREOCHROMIS
SP) Y TILAPIA NILOTICA (OREOCHROMIS
NILOTICUS) POR PCR EN TIEMPO REAL

Frank Barreiro¹ ², Tec. Acui, Est MVZ; James Betancur¹, Zoot; Henry Ostos¹, M.D. MSc. Genética

¹ Grupo de Investigación Laboratorio de Medicina Genómica, Universidad Surcolombiana, Neiva,
Colombia.
² Grupo de Investigación IMEVET, Universidad Corhuila, Neiva, Colombia.

barreirosanchez@Gmail.com


INTRODUCCIÓN
 Las infecciones estreptocóticas se han
diagnosticado en especies de cultivo y
peces salvajes.
 El Streptococcus iniae ha sido identificado
por la Asociación Americana de tilapia como
el más importante grupo de patógenos que
afecta a la industria de cultivo de tilapia.
 Importancia por el reporte de infecciones
zoonóticas por Streptococcus iniae.


Streptococcus iniae
PCR EN TIEMPO REAL
 Es una técnica para la síntesis “in vitro” de
secuencias específicas de ADN. Las siglas PCR
significan “Polimerase Chain Reaction”:
reacción en cadena de la polimerasa.
Desarrollada originalmente por Kary Mullis en la
década de los 80, por lo cual se le adjudicó el
Premio Nobel de Química en 1993

 La PCR En tiempo real es una técnica con alta
sensibilidad, especificidad y semiautomatizada,
que evita el manejo post PCR. Emplea sondas
(taqman) de secuencias marcadas con
fluorocromos.

OBJETIVOS
Objetivo general:
 Identificar la distribución de la infección por
Streptococcus iniae en diferentes órganos de
tilapia roja (Oreochromis sp) y tilapia nilotica
(Oreochromis niloticus) diagnosticada por
PCR en tiempo real.


Objetivos especifico
 Determinar e identificar la distribución de la
infección en Cerebro, Hígado y Corazón.

 Describir hallazgos histopatológicos en
cerebro, hígado y corazón de individuos
infectados con Streptococcus iniae.

METODOLOGÍA

PROTOCOLO DE PCR EN TIEMPO REAL
Control Positivo
 Se realizó la extracción de DNA de los cultivos puros de la
cepa de Streptococcus iniae, (fue adquirida de ATTC No.
29178)

Diseño de primers
 El grupo Laboratorio de Medicina Genómica, diseño los
primers, a partir de las secuencias de la accesión No.
Y07622.1 proteína Lactato oxigenasa (lctO) (S. iniae). En
esta región se diseñaron los primers específicos de la
especie, utilizando el Software Primer Express 3.0 Applied
Byosistems, el equipo utilizado fue Applied Biosystems
7300 Real-Time PCR System+
Primers utilizados para el diagnóstico de
Streptococcus iniae por PCR en tiempo real


Forward GTT TTC TTG AAG CTA TTG CAG GTT T
Reversed CGC GCA AGG GTT TCA TG
Sonda VIC-CTGCGGTTGCCATACCAGCAAGTATTCTA- TAMRA
Reactivo Cantidad
Taqman Universal PCR master mix (2X)
12.5 ul
Taq man (sonda) 0.5 ul
Primer F (10 uM) 1.25 ul
Primer R (10 um) 1.25 ul
DNA 1 ul
Agua 8.5 ul
TOTAL
25 ul
Protocolo de perfiles de temperatura para PCR en tiempo real.
50 ºC por 2 minutos
95 ºC por 10 minutos
40 ciclos
95ºC por 15 segundos
60 ºC por 1 minutos
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
 Los resultados se analizaron con estadística
descriptiva y análisis de frecuencias con el
paquete estadístico INFOSTAT
RESULTADOS
Extracción de DNA a
partir de muestras
congeladas a -20°C.
La cantidad de DNA
obtenido con el kit
comercial de Quigen
según el protocolo para
bacterias de la misma
marca comercial se
encuentra en la tabla
siguiente, la medición se
realizó con el equipo
NanoDrop 2000

ÓRGANOS POSITIVOS PARA LA INFECCIÓN
STREPTOCOCCUS INIAE.
Individuo Órganos infectado
130 Corazón - Hígado
332 Cerebro
333 Corazón
414 Corazón
416 Corazón
59 Hígado
627 Corazón - Cerebro
628 Hígado – Cerebro
629 Hígado
77 Hígado – Cerebro

CURVAS DE INDIVIDUOS POSITIVOS
SENSIBILIDAD DE LA PCR TIEMPO REAL

ESPECIFICIDAD DE LA PRUEBA PCR TIEMPO
REAL
CONCLUSIONES
 Primer reporte para Colombia para esta enfermedad.
 Por la magnitud del problema de Streptococcus iniae a
nivel mundial, se decidió mirar la distribución de la
infección por órgano.
 La importancia de seguir con monitoreos continuos, por
la implicaciones que tiene S. iniae en la salud de los
peces y como agente zoonótico.
 S. iniae es una infección muy grave y puede tener
grandes problemas sobre la actividad acuícola del Huila y
sobre los recursos icticos nativos.
 El diagnostico por PCR en tiempo real es una
herramienta de alta sensibilidad, especificidad y rapidos
resultados para este patógeno.