You are on page 1of 19

Contrastação Negativa

Getúlio
Lucelia
Paula
Contrastação Negativa
Os íons de metais pesados e de fina granulação
(urânio, tungstênio e molibdênio)
são usados para:
- contrastar
- bloquear parte do feixe de elétrons

As suas imagens apresentam-se como num
negativo, isto é, as macromoléculas ficam claras,
mais transparentes aos elétrons do que o fundo da
preparação.

Partículas CMV (Cucumber mosaic vírus) - acetado de uranila 2%.
• No contraste negativo, as
macromoléculas não são coradas, mas
sim rodeadas pelo denso contrastante.
• O contraste negativo não é usado para
corar materiais seccionados, mas sim
espécimes inteiras, como vírus,
bactérias, organelas celulares, etc.
• É usada para avaliar/estimar frações
celulares (ribossomos, vesículas,
tubulos, etc) e para promover um
diagnostico clinico rápido de algumas
infecções virais.
• Uma boa contrastação negativa nos
revela o contorno e a forma das
estruturas que queremos analisar.
a) Bacteriófago; b) Vírus da batata; c) Adenovírus; d) Vírus da
influenza



• As espécimes podem ser visualizadas com apenas minutos pós-
coloração.


• A obtenção de uma boa imagem depende do grau de limpeza da
suspensão, do seu pH e da afinidade dos contrastantes com as
suspensões.

Principais contrastantes
Ácido fosfotúngnstico (k-PTA):
• Utilizado como contrastante padrão
• pH 5 a 8 ( ajustado com KOH)
• Estável por semanas refrigerado se o
pH estiver abaixo de 6
• Vírus, Bactérias, frações celulares,
secções congeladas e macromoléculas
(DNA, actina, enzimas...).
Adenovírus
Influenza
Acetato de uranila (UA):
• Solução a 1% em etanol a 45% ou 2%
em água
• pH 4.8
• Emprega-se preferencialmente para a
contrastação de macromoléculas, vírus
de hepatite B, bactérias e microfibrilas
• Deve ser centrifugado imediatamente
antes do uso para a remoção de
precipitados
• Guardar protegido da luz
• Quando estiver turvo descartar
• Deve-se evitar o contato com soluções
de fosfato, pois irá ocorrer a
precipitação dos sais de uranila.
• É compatível com soluções de
cacodilato e tris.

Partículas de CMV (Cucumber mosaic vírus)
Molibdato de amônia (AM):
• Emprega-se de 2% a 4% em água
• pH 6 a 7.4
• Precipita facilmente nas preparações
• É usado para membranas, subunidades
enzimáticas e frações celulares.
• O contraste obtido com esse método
não é tão bom quanto o acetato de
uracila, mas é similiar ao K-PTA.
• Permite melhor resolução para detalhes
extremamente finos.
• Não é tão estável quanto o K-PTA, mas
possui vida útil similar ao acetato de
uranila.


Influenza


Citrato de uranila (UC):
• Solução a 2% em água
• pH 6.5
• Utilizado em macromoléculas
• Deve ser centrifugado imediatamente antes do uso pois possui uma
granulação de fundo.


Oxalato de uranila
• pH 6.5 a 6.8
• Usado para moléculas pequenas


Silicotungstato de sódio (SST):
• Usa-se a 1% em água
• pH até 7.2
• Sua durabilidade fica limitada de 1 a 2 meses
• É excelente para ressaltar pequenos detalhes estruturais
• Fornece um contraste “suave”

Procedimentos para contrastação
negativa
• Revestir os grid com película de carbono.
Métodos de preparo
• Drop method:
• Grid revestido com formar é preso com pinça e uma gota da amostra é
depositada no grid. Aguardar 30 segundos para permitir a absorção da
amostra no substrado;
• Adicionar o contrastante e aguardar secar
• Visualizar no microscópio
• Flotation method:
• Grid revestido com formar/colodium é colocada flutuando em uma gota da
amostra depositada em Parafilm. Aguardar 1 minuto para a absorção da
amostra.
• Transferir o grid para uma gota de contrastante e aguardar ~30 minutos.
• Visualizar no microscópio
Drop method x Flotation method
Fazendo imagens de componentes
subcelulares utilizando a contrastação
negativa
• Quando componentes subcelulares são liberados das células é
importante determinar a pureza da preparação ou estudar
componentes celulares:
• A estrutura ribossômica foi elucidada após milhares de contrastações
negativas para gerar um modelo 3d da organela.
• Pode-se visualizar Membranas fracionadas, filamentos citoplasmáticos como
actina e miosina, mitocôndrias.
• A única limitação é que as estruturas não podem ser muito espessas ao ponto
de impedir a passagem dos elétrons.
Estrutura Ribossômica em 3d

Contrastação negativa de vírus
• Técnica utilizada a mais de 50 anos;
• Consiste em misturar uma gota da preparação viral com uma gota do
contrastante em seguida depositar o grid flutuando em cima da mistura por 1
minuto.
Imunomarcação na contrastação
negativa
• Permite a detectar a presença/ausência de proteínas, antígenos, e
outras macromoléculas sobre a superfície e/ou interior de espécimes
biológicos em suspensão.
• Partículas virais, fragmentos de células, bactérias, amostras de
lipoproteínas, e outros espécimes biológicos podem ser
imunovisualizados com esta técnica
Imunomarcação com partículas de ouro