Universidad Central del

Ecuador

Facultad de Ciencias
Químicas

Química A. Cuantitativa 2

HPLC


HPLC Cromatografía líquido de alta resolución
Encuadra dentro de la
cromatografía de elución.

Un líquido circula en íntimo
contacto con un sólido u otro
líquido inmiscible, al
introducir una mezcla de
substancias en la corriente de
la fase móvil.

Terminado el recorrido de la
muestra por la columna, cada
substancia introducida en el
sistema eluirá con tiempo
diferente.
INSTRUMENTACIÓN
Reservorio Detector
Columna
Inyector
Bomba
Uniones
Tuberías
Reservorio
Uniones
Tuberías
Contiene la fase
móvil
Reservorio-bomba
Bomba-inyector
Inyecto-columna
Columna-detector
Detector-d. en serie
Tuberías-otros
componentes
Puede emplearse
cualquier frasco de
laboratorio
(vidrio o
polímeros)
Acero inoxidable o
poliméricas
Diámetro:
Externo, estándar 1/6plg
Interno, muestra-fino
No muestra-grueso
Unión de dos piezas
de acople perfecto
Hembra y macho
- Inerte con fase móvil y
muestra.
- Cerrar herméticamente
- No contribuir al
ensanchamiento de
banda extracolumnar.
Longitud
Un pistón, dos pistones, tres
pistones, bomba tándem y a
diafragma
Bomba
Reservorio-inyector-columna
Varían caudal entregado por
dos mecanismos:
Recorrido y velocidad de
pistón
Volumen de la cámara
del pistón 35-400 μl
-Permite cambio de
solvente
La bomba impulsa la fase móvil en
ciclos alternados, causando
caudales discontinuos
Características:
Caudal. 0,1 y 10,0 ml/min y presiones de 6000psi (408,26)
Exactitud de caudal. Divergencia entre caudal de trabajo
establecido y el real entregado.
Ruido. Variaciones denominadas pulsaciones.
Deriva. Cambio del solvente entregado en periodos largos.
Sistema de corte.
Bombas reciprocantes
Caudal de trabajo variable.
μl/min ml/min
Bombas jeringa
Válvula de
entrada
Pistón
Válvula de
salida
Atenuadores de pulso
Engranajes no
circulares
Dos o más pistones de
funcionamiento
sincrónico
Introducción de la
muestra se lleva en
dos etapas:
Inyector
Permite caudal continuo
del solvente
2. Giro de la
válvula
1. A presión
atmosférica
Características:
- Fácil de operar
- Inerte
- Preciso
- No diluciones
Inyector de válvulas
Columna
En elle se da la
separación
Características de la columna que influyen sobre su capacidad de
separación: Diámetro interno, longitud, conexiones, relleno y tamaño
de la partícula
Las más utilizadas, las
de relleno
Relleno
Filtro
Tubo 1/6plg
Diámetro 2-60mm
Longitud 5-30cm
Columnas microbore
Diámetro 2-05nm
Longitud 25-100
Cambio en alguna propiedad
física de la fase móvil
Detectores
Permite ver y ubicar en tiempo y espacio la
posición de cada componente
Características:
Tener un amplio rango dinámica de respuesta
Poseer una repuesta lineal
No contribuir al ensanchamiento de banda
extracolumnar
Responder a todo los solutos
Tener la sensibilidad apropiada
No afectarse por cambios de temperatura
Poseer una buena relación señal/ruido
No destruir la muestra
Tener una constante de tiempo baja
Detectores
generales
Detectores
selectivos
Detector
electroquímico
Detector de
fluorescencia
Detector UV
D. De índice de
refracción
Detector de onda variable
o espectrofotométrico
Interferómetro
Deflexión
Fresnel
Propiedad propia
del soluto
Detector de onda fija o
fotométrico
Partición
Adsorción
BASES DE LA SEPARACIÓN
Intercambio iónica
Exclusión molecular
SOLVENTES
Propiedades de los solventes
• Alto poder solubilizante en las muestras
• Baja reactividad
• Compatibilidad con el detector utilizado
• Baja viscosidad
• Seguridad
• Alto grado de pureza

Desgasificación de solventes
• El Oxígeno Disuelto.- puede producir mayor
interferencia en los detectores de fluorescencia y
electroquímicos.
• El Nitrógeno Disuelto .- puede producir burbujas en
la columna de HPLC y cuando el solvente entra al
detector produce picos falsos y desviaciones de la
línea base.
• El Dióxido de Carbono disuelto.- Puede ser la causa
de los cambios de pH en el sistema de solvente.

Métodos de Desgasificación de
Solventes en HPLC
• Sonificacion
• Burbujear helio
• Desgasificación electrónica en la
línea de flujo
• Desgasificación al vacio en la línea
Elución
• En cromatografía de líquidos es posible
trabajar en dos modalidades:
• Isocrática.- La fase móvil mantiene la misma
composición durante la elución.
• Gradiente.- Modifica gradualmente la
composición de la fase móvil durante la
cromatografía.
Influencia de la fase móvil en la
separación
CROMATOGRAFÍAS
Cromatografía de Fase Normal
Cromatografía de Intercambio Iónico
Cromatografía de Exclusión Molecular
Cromatografía en Fase Normal
NP-HPLC
Polaridad
media alta
Alta actividad
de material
de relleno
Isómeros posicionales
Inconveniente
Fase
estacionaria
Polar
Sílice
Alúmina
Fase móvil
No polar
Mezcla de
solventes
Sílice
Alto poder de
adsorción
60-300A˚
Alumina
100-200˚A
Modificadores
Presencia de grupos silanol
Agua
•Menor variación en la retención de los analitos entre muestra
y muestra.
•Aumento sustancial en la capacidad de carga de la columna
•Mayor eficiencia
•Reducción de la tendencia del adsorbente a catalizar las
reacciones de los analitos durante la separación.
Cromatografía de Intercambio Iónico
Fase estacionaria contiene los grupos funcionales iónicos y
retiene al soluto
Intercambio aniónico
Intercambio catiónica
Utilizado para la separación de iones inorgánicos
Especies ionizables son ácidos y bases débiles
Materiales de relleno
Intercambiadores
Aniónico
Grupo ionogénico
Acido
Catiónicos
Ionogénico
Básicos
Mayor difusión
fuertes
Clasificación :
Polímeros orgánicos
Intercambiadores de fase ligada
Óxidos inorgánicos
Intercambiadores peculiares
Fase móvil
Acuosa
pH y fuerza iónica controlados
Variables en la cromatografía de intercambio iónico
Cromatografía de Exclusión Molecular
•Separación por dimensión molecular
•Picos angostos
•Tiempos de separación cortos
•Elución predecible
•No hay perdida de muestra
•No hay desactivación de la columna
Mecanismo de separación
Exclusión molecular
Fase estacionaria
Geles Semirrígidos
Geles Blandos
Las columnas de Exclusión tiene una longitud de 25 a 30cm de
longitud y 0,4 hasta 0.8cm diámetro
Fase Móvil
Preparación de las muestras
1. Selección del método
• Propiedades físicas
• Concentración analito en la muestra


Preparación de las muestras
• Forma de presentación del analito
• Tipo de detector

Tratamiento previo
Depende tipo de muestra
• Liofilización y Evaporación
• Filtración y centrifugación



Desproteinización
• Utilizando solventes orgánicos(precipitación)
• Ultrafiltración

Extracción liquido solido
• Solubilizacion de la muestra solida
Extracción liquido-liquido
• Equilibrio entre líquidos inamisibles
APLICACIONES DEL
HPLC
Campos de Aplicación de HPLC
Fármacos: Antibióticos,
sedantes esteroides,
analgésicos
Bioquímica: Aminoácidos,
proteínas, carbohidratos,
lípidos
Productos de alimentación:
Edulcorantes artificiales,
antioxidantes, aflatoxinas,
aditivos
Productos de la industria
química: Aromáticos
condensados, tensoactivos,
propulsores, colorantes
Contaminantes: fenoles,
Pesticidas, herbicidas, PCB
Química forense: Drogas,
venenos, alcohol en sangre,
narcóticos
Medicina clínica: Ácidos
biliares, metabolitos de drogas,
extractos de orina, estrógenos.
El análisis de medicamentos constituye la aplicación mas grande
de la Cromatografía HPLC que nos sirve para determinar los
componentes activos de diferentes productos usados en la
industria farmacéutica como por ejemplo en las tabletas
analgésicas
La disponibilidad de los patrones analíticos es un aspecto crítico en los
métodos para el análisis cuantitativo de las antocianinas en desarrollo. Las
antocianinas cianidina-3-O-glucósido y cianidina-3-O-rutinósido se aislaron a
partir de muestras de acai liofilizado que es un fruto de la palma conocida
redondo y púrpura en Brasil,
Condiciones de HPLC
La cromatografía se realizó en una columna Waters
®
La columna utilizada fue
una columna (150 mm x 4,6; 3,5 micras). La fase móvil consistió en 10% de
ácido fórmico acuoso (disolvente A) y metanol (disolvente B). Se programó La
válvula de selección para cambiar a canalizar una al principio de la elución
cianidina-3-O-glucósido (a 16,2 minutos) y volver a descargar posición después
de su elución parcial (en 18,4 minutos). El mismo procedimiento se realizó con
cianidina-3-O-rutenoside, pero en este momento se ha programado la válvula
de selección para cambiar al canal dos en 21,4 minutos y volver a descargar
posición en 22,9 minutos. El procedimiento de recogida se realizó con 30
inyecciones del extracto.
Para determinar la concentración de las antocianinas en cada caso, se comparó el área del pico de la muestra
con el área del pico del estándar externo, reportando en mg (100 g de muestra)1
GRACIAS…..