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INMUNOLOGÍA ESPECIAL

GENERALIDADES
Lic. TM Henry A. Campos Pajuelo
06/ 03/ 2013
◉ Métodos analíticos basados en la reacción
Antígeno - Anticuerpo (Ag-Ac).
· Antígeno: Estructura capaza de generar una
respuesta inmunológica
Y Propios
Y No propios
ANTÍGENO
EPÍTOPE
◉ Proteína producida por el cuerpo en respuesta a
algo extraño.
› Analito: Todo lo que se mide en una prueba de
laboratorio:



· Anticuerpo
· Antígeno
CADENA LIGERA
CADENA PESADA
ZONA
BISAGRA
PUENTES DISULFURO (2)
REGIONES
CONSTANTES
REGIÓN
VARIABLE
SITIO DE UNIÓN
ANTIGÉNICA
(PARATOPO)
ESTRUCTURA DEL ANTICUERPO IgG
TIPOS DE ANTICUERPO
CASO HIPOTÉTICO
VIRUS EPÍTOPE
VIH A, B, C, D, E
HEP B A, B, D, E, F
CASO HIPOTÉTICO
VIRUS EPÍTOPE EPÍTOPE ESPECÍFICO
VIH A, B, C, D, E C
HEP B A, B, D, E, F F
◉ Mezcla de anticuerpos (antisuero policlonal) cada
uno de los cuales puede unirse a diferentes puntos
de unión del antígeno o epítope.
ANTÍGENO
DETERMINANTES
ANTIGÉNICOS
INOCULACIÓN
DEL Ag EN
CONEJO
DESARROLLO DE CÉLULAS PLASMÁTICAS
(LINFOCITOS B ACTIVADOS) Y FORMACIÓN
DE ANTICUERPOS
CÉLULA PLASMÁTICA
ANTICUERPO
LOS DIVERSOS ANTICUERPOS FORMADOS ESTÁN
DIRIGIDOS A DIVERSOS EPÍTOPES
PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS





ANTISUERO:


MEZCLA DE
ANTICUERPOS
(POBLACIÓN
HETEROGÉNEA)
ANTICUERPOS POLICLONALES ANTI ANTÍGENO X
◉ Reactivo anti antígeno X
A
d
nti Epítope 1
el Ag X
Anti Epítope 3
del Ag X
Anti Epítope 2
del Ag X
Anti Epítope 4
del Ag X
Anti Epítope 7
del Ag X
Anti Epítope 6
del Ag X
Anti Epítope 5
del Ag X
◉ Muy específicos para un epítope simple en un
antígeno multivalente. Se producen a partir de
una línea celular simple usando tecnología para
hibridomas y líneas celulares de mieloma de ratón.
· Hibridomas son células tumorales productoras de anticuerpos
que producen varias copias del mismo anticuerpo.
ANTÍGENO
DETERMINANTES
ANTIGÉNICOS
INOCULACIÓN
DEL Ag EN
RATÓN
DESARROLLO DE CÉLULAS PLASMÁTICAS
(LINFOCITOS B ACTIVADOS) Y FORMACIÓN
DE ANTICUERPOS
CÉLULA PLASMÁTICA
ANTICUERPO
LOS DIVERSOS ANTICUERPOS FORMADOS ESTÁN
DIRIGIDOS A DIVERSOS EPÍTOPES
◉ CÉLULAS TUMORALES: Células de mieloma de ratón
· Se van a fusionar con las células plasmáticas (linfocitos B activados)
productoras de anticuerpos
Estas células pueden crecer
indefinidamente en cultivo
celular (inmortales)
LOS LINFOCITOS B OBTENIDOS DEL BAZO DEL RATÓN SE FUSIONAN CON
LAS CÉLULAS DE MIELOMA DE RATÓN PARA FORMAR LAS HIBRIDOMAS
HIBRIDOMAS
(inmortales)
SELECCIÓN Y
AISLAMIENTO DE
HIBRIDOMAS
FORMADAS
Los anticuerpos que forman las
diferentes colonias son analizados
para conocer su capacidad de unirse
a un antígeno determinado
El hibridoma más eficiente y que
resulte de interés se expande
Y Por cultivo celular
Y Por inducción de tumores en ratones
LOS ANTICUERPOS
MONOCLONALES
PRODUCIDOS SE PURIFICAN
Reconocen específicamente a un único epítope de
un determinado antígeno (población homogénea)
◉ Inmunoensayos Directos: Medición directa del
complejo Ag-Ac.
· Precipitación
· Inmunodifusión
· Aglutinación
· Reacción de Widal
· Floculación
· VDRL




◉ Inmunoensayos Indirectos: Requieren el uso de
material marcado para medir el complejo Ag-Ac
LA MARCACIÓN DE ANTICUERPOS O DE ANTÍGENOS PERMITEN LA DETECCIÓN DEL
COMPLEJO Ag-Ac
-Ac
INMUNOENSAYOS INDIRECTOS
◉ Clasificación de los Inmunoensayos Indirectos
› Según el tipo de marcador
· Radioinmunoensayos
· Enzimoinmunoensayos
· Fluoroinmunoensayos
· Quimioinmunoensayos


› Según el método de separación
· Homogéneos
· Heterogéneos


› Según el diseño del ensayo
· Competitivos
· No competitivos (sándwich)
Radioinmunoensayos
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◉ Se utiliza un marcador radioactivo: I, H
◉ La medición se realiza con un contador de
centelleo
› RIA (Radioinmunoensayo)
› IRMA (Ensayo Inmunoradiométrico)
R
R
RIA
COMPETITIVO
IRMA
NO COMPETITIVO
Enzimoinmunoensayos
◉ Se utiliza una enzima como marcador: Fosfatasa
Alcalina, Peroxidasa
◉ La medición se realiza colorimétricamente
›ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzima)
›WESTERN BLOT(Electroinmunotransferencia)
E
E
ELISA DIRECTO
POCILLO RECUBIERTO CON ANTICUERPOS
ELISA DIRECTO
INCUBACIÓN CON MUESTRA PROBLEMA
ELISA DIRECTO
RESULTADO DEL PRIMER LAVADO
ELISA DIRECTO
INCUBACIÓN CON CONJUGADO
ELISA DIRECTO
RESULTADO DEL SEGUNDO LAVADO
ELISA DIRECTO
INCUBACIÓN CON SUSTRATO
ELISA DIRECTO
FORMACIÓN DE PRODUCTOS COLOREADOS
ELISA DIRECTO
PRODUCTO FINAL LUEGO DE LA ADICIÓN DE SOLUCIÓN DE PARADA
WESTERN BLOT
Ac.
Primario
(muestra)



Bandas
(antígenos)
Ac. Secundario
(conjugado)
Sustrato
Membrana de
nitrocelulosa
Antígenos
Fluoroinmunoensayos
◉ Se utiliza como marcador una sustancia
fluorescente: isotiocianato de fluoresceína,
ficoeritrina, ficocianina
›IFD (Inmunofluorescencia Directa)
›IFI (Inmunofluorescencia Indirecta)
›Citometría De Flujo
F
F
IFD
Tejido (muestra) que
presenta el Ag de interés
Ac marcado (reactivo)
que reconoc e el
antígeno de interés
Observación del preparado
con el microscopio de
fluorescencia
Quimioinmunoensayos
◉ Se utiliza como marcador una sustancia que
genera luminiscencia: luminol, isoluminol, éster de
acridina, rutenio
›QL (Quimioluminiscencia)
›EQL (Electroquimioluminiscencia) Q
Q
EQL
CT O AG O ELE ROD - M NET


Campo eléctrico
Luminiscencia
Antígeno de interés
(muestra)
Homogéneos: El complejo Ag-Ac no requiere ser
aislado para la lectura
· Monitoreo terapéutico de fármacos, detección
de drogas de abuso


Heterogéneos: El complejo Ag-Ac requiere ser
aislado para la lectura (lavados)



· ELISA
TUBO DE
REACCIÓN
REACTIVO DE Ac
DE FASE SÓLIDA
SE MIDE EL
COMPLEJO Ag-Ac
LAVAR Y AISLAR EL
COMPLEJO Ag-Ac
TÉCNICA HOMOGÉNEA
TÉCNICA HETEROGÉNEA
MUESTRA (Ag)
+


REACTIVO DE Ac
MARCADO
+
INMUNOENSAYOS HOMOGÉNEOS Y
HETEROGÉNEOS
Competitivos
No competitivos (sándwich)
COMPETITIVO
Cantidad limitada de
anticuerpos
FORMATO COMPETITIVO
CONCENTRACIÓN
L
E
C
T
U
R
A
RELACIÓN
INVERSA
NO COMPETITIVO (SÁNDWICH)
FORMATO NO COMPETITIVO
CONCENTRACIÓN
L
E
C
T
U
R
A
RELACIÓN
DIRECTA