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Micro disección Láser

Alumno: Pablo Vilches V

Introducción
La micro disección por captura láser es una
tecnología que permite separar células
únicas o pequeños grupos celulares de
manera selectiva, eficiente y rápida, a partir
de cortes, extendidos o cultivos.

Permitiendo la investigacion sistemática de
calidad y cantidad.

 ADN
 ARN
 Proteínas
Láser

 Básicamente dispositivo capaz de emitir un haz de luz muy
potente.
 El corte por láser es un procedimiento de división térmico.
Donde el rayo se genera (en la fuente o resonador) y se guía
mediante un espejo al cabezal de corte, donde se enfoca a un
diámetro muy reducido y de mucha potencia con una lente.
El rayo láser enfocado entra en contacto con la muestra y hace que
ésta se funda.
En términos simples como funcionan el láser


 Capture IR Laser preserva la calidad del ARN para áreas pequeñas y
disecciones de células individuales

 El láser ultravioleta (UV) puede ser utilizado para cortar el tejido y facilitar la
captura o para eliminar tejido no deseado.

Técnica (LCM)

 El sistema de micro disección por captura láser (LCM) ArcturusXT está montado
sobre un microscopio óptico invertido (Nikon Eclipse Ti-E) que permite
observar el tejido y seleccionar las regiones de interés a través de una
computadora.

 Una membrana termo fusible de 6mm de diámetro pegada a una pequeña pieza
plástica llamada CapSure es el elemento que captura la muestra.


 El CapSure se coloca apoyado sobre el corte de tejido en la región de interés, luego
un láser infrarrojo (IR) de baja energía funde la membrana específicamente sobre las
células seleccionadas adhiriéndolas a la membrana.


• El láser ultravioleta (UV) puede ser utilizado para cortar el tejido y facilitar la
captura o para eliminar tejido no deseado.

• El CapSure se levanta llevando consigo el tejido adherido a la membrana.

• Una vez terminada la microdisección se observa la eficiencia y se documenta
fotografiando el resultado.
 El proceso se realiza en
forma automatizada,
controlado por computadora
con la mínima intervención
manual necesaria para
abastecer al instrumento y
retirar las muestras.

 Finalmente cada CapSure
con el tejido capturado se
encastra con un tubo de 0,5
ml conteniendo la solución
de extracción para las
moléculas de interés.
Con que cuenta el LCM

 El sistema se encuentra montado sobre un microscopio invertido Nikon
Eclipse Ti-E de objetivos y platina motorizada.

 Cuenta con óptica de campo claro y contraste de fase y dos cámaras
CCD color, una para operar el sistema en vivo y otra para fotografías
de alta resolución.

 El equipo cuenta con 4 objetivos de aire y un lente 1,5x que aumenta la
magnificación de cualquier objetivo en un 50%.
Consejos generales:
 Extracción rapida
 Fijación Oportuna ( evitar la auto
degradación de biomoléculas)
 Evitar contaminación de cualquier
tipo ( recambio de guantes, uso de
materiales nuevos en lo posible)
 Limpieza de los equipos
 Uso de materiales y reactivos libres
de nucleasas.

En general un manejo prolijo y limpio ya que las muestras pueden ser
contaminadas muy fácilmente.

Preparación de la muestra
Reconocimiento de las células de interés 
De esto depende la selectividad de la micro disección
2 casos posibles
 Observar al microscopio y reconocer estructuras en cortes que NO
embebidos en medio de montaje.

 Tinción una marcación específica. La micro disección láser
es compatible con métodos para marcar células selectivamente.
(inmunohistoquímica o hibridación in situ.)
TINCIONES
La tinción nuclear realizada con reactivos debe ser libres de nucleasas y
proteasas para que no interfieran con reacciones de RT- PCR que
puedan generarse a posterior con ARN aislado.

 Tejido congelado (Kit Histogene).
 Hematoxilina (Mayer) y Eosina (congelado, FFPE)
 Cresilo Violet (secciones congeladas)
 Azul de toluidina (sección congelada)

 Tejido fijado y parafinado (Paradise Staining Kit).
 Hematoxilina (Mayer) y Eosina (congelado, FFPE)

Obs.
 La tinción previo a la micro disección.
 Tiempo total tinción debe ser tan corto como sea posible.
 Compatible con fluorescencia (FISH / HIQ).
Utilidades en:
 Microdisección láser y los métodos de biología molecular
 La investigación del ADN
 Investigación ARN
 Proteómica
 Los cultivos de células
 Investigación de Plantas
 Medicina forense
 Neurología
 Investigación del cáncer
Microdisección láser y los métodos de
biología molecular

El general el éxito de estas técnicas depende de precisión y la
NO presencia de agentes contamintes. El aislamiento sin contacto y la
separación ofrecida por el método de microdisección por láser es
especialmente adecuado para las siguientes estructuras:

 Las células individuales de muestras de tejidos
 Componentes de la célula
 Las áreas de tejido
 Cromosomas
 Cultivos celulares

Métodos biológicos moleculares y bioquímicos:
- PCR
- PCR en tiempo real
- transferencias Southern, etc…

Investigación ARN
-Análisis de la expresión génica (información cuantitativa y cualitativa sobre
la actividad genética). Tecnología de microarrays.
-Examinar la expresión de muchos genes al mismo tiempo.
Proteómica
La proteómica (dilucidación de la estructura, el análisis cuantitativo de la
expresión de proteínas y sus interacciones)
- información sobre los componentes de las vías metabólicas y circuitos
reguladores.

Microdisección láser es de nuevo útil en este caso para la selección y
aislamiento de células en preparación para análisis proteómico.
Conclusión
 Esta tecnología que originalmente fue desarrollada para el análisis
molecular de tumores, hoy puede ser aplicada en una gran variedad
de tejidos, y abre nuevas posibilidades en el estudio de las bases
moleculares de numerosas enfermedades.

 Siendo una gran herramienta para la investigación y desarrollo en
biomedicina.
Bibliografía
 http://www.leica-microsystems.com/science-lab/topics/laser-
microdissection/
 http://www.nikoninstruments.com/es_AMS/Centro-de-
Informacion/Microdiseccion-Laser
 http://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-
microdissection/applications-of-laser-microdissection/
 LCM Protocols and Techniques/2009 LCM User Meeting/Shirley
Chu/Applications Scientist/Arcturus LCM Products