You are on page 1of 28

PHƢƠNG PHÁP

KHỐI PHỔ
Bùi Văn Hiệu - NguyễnThi Ngọc
Lơp: 10B CNSH - KH
NỘI DUNG CHÍNH
I. Tổng quan về khối phổ
1. Khối phổ là gì?
2. Nguyên tắc hoạt động và nguyên lý chung.
II. Sự kết hợp giữa khối phổ các phƣơng pháp
khác
1. Sắc ký khí kết hợp với khối phổ
2. Sắc ký lỏng kết hợp với khối phổ
3. Kết hợp điện di hai chiều-khối phổ
III. Các phƣơng pháp ion hóa hiện đại
IV. Xác định protein sử dụng khối phổ
TỔNG QUAN VỀ KHỐI PHỔ
KHỐI PHỔ LÀ GÌ?
• Là phương pháp nghiên cứu các chất bằng
cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân
tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của
các hạt mang điện hay ion trong một điện
trường hoặc từ trường nhất định. .
• Kĩ thuật này có nhiều ứng dụng, thường
được kết hợp với một số sinh học phân tử
khác như:
– Khối phổ kết hợp với sắc ký khí.
– Khối phổ kết hợp với sắc ký lỏng.
– Khối phổ kết hợp điện di

Máy khối phổ

• Là một thiết bị dùng cho phương pháp phổ
khối, cho ra phổ khối lượng của một mẫu, để
tìm ra thành phần của nó.
• Có thể ion hóa mẫu và tách các ion của nó
với các khối lượng khác nhau và lưu lại thông
tin dựa vào việc đo đạc cường độ dòng ion

. Một khối phổ kế thông thƣờng gồm 3 phần:

• Phần nguồn ion
• Phần phân tích khối lượng
• Phần đo đạc.
Cấu tạo:

• Bộ phận đưa mẫu;
• Nguồn ion hoá;
• Hệ thống bơm chân không;
• Bộ phân tích khối đo tỷ lệ khối lượng/điện
tích của phân tử ở dạng ion hoá (m/z);
• Bộ phận đo tín hiệu xác định số lượng
các ion ở mỗi giá trị m/z;
• Hệ thống phân tích số liệu, bao gồm máy
tính cấu hình cao với các phần mềm
chuyên dụng.
Sơ đồ cấu tạo hệ máy khối phổ vơi các khả năng lắp
đặt khác nhau
Theo tính năng bộ ghi, người ta chia các máy
khối phổ thành hai loại:
• Máy khối phổ ký ghi bằng kính ảnh. Tín
hiệu phổ được ghi bằng kính ảnh ở dạng
vạch có độ đen khác nhau.
• Máy khối phổ kế: các tín hiệu của chùm
ion được ghi dưới dạng xung điện bằng
các dao động ký điện tử nhiều kênh, hoặc
đưa vào máy tính điện tử,tín hiệu sẽ được
đưa ra dưới dạng bảng số hoặc đồ thị thích
hợp.
Ngày nay trong phân tích khối phổ người ta
dùng các máy khối phổ kế.


Nguyên lý hoạt động của máy khối phổ

Nguyên lý hoạt động của máy khối phổ

• Mẫu chất cần phân tích sẽ được chuyển thành
trạng thái hơi, sau đó mới bắt đầu quá trình
đo khối phổ
• Để đo được đặc tính của các phân tử cụ thể,
máy khối phổ sẽ chuyển chúng thành các
ion,kiểm soát chuyển động của chúng bởi các
điện từ trường bên ngoài
• Quá trình được thực hiện trong môi trường
chân không

• Trong khi áp suất khí quyển vào khoảng 760
mmHg, áp suất môi trường xử lý ion thường từ
10
-5
đến 10
-8
mmHg (thấp hơn một phần tỉ của
áp suất khí quyển).
• Ion sau khi được tạo thành sẽ được phân tách
bằng cách gia tốc và tập trung chúng thành một
dòng tia mà sau đó sẽ bị uốn cong bởi một từ
trường ngoài.
• Các ion sau đó sẽ được thu nhận bằng đầu dò
điện tử và thông tin tạo ra sẽ được phân tích và
lưu trữ trong một máy vi tính.
II. Sự kết hợp khối phổ và các
phƣơng pháp khác
1. Khối phổ kết hợp với sắc kí khí
(Gas Chromatography Mass Spectometry)
• Phương pháp Sắc ký khí kết hợp với Khối
phổ(viết tắt là GC-MS hoặc GCMS) là một
phương pháp mạnh mẽ với độ nhạy cao được
sử dụng trong các nghiên cứu về thành phần
các chất trong không khí.
• Bản chất GC-MS là sự kết hợp của Sắc ký khí
(Gas Chromatography) và Khối phổ (Mass
Spectometry). Ngưỡng phát hiện của phương
pháp này là 1 picogram.
Cấu tạo của GC-MS
- Sắc ký khí (GC): Phân tách hỗn hợp hóa chất thành một
mạch theo từng chất tinh khiết
- Khối phổ (MS): ) Xác định định tính và định lượng

• A. Cửa tiêm mẫu (injection port): 1 microliter
dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ được tiêm
vào hệ thống tại cửa này. Mẫu sau đó được
dẫn qua hệ thống bởi khí trơ, thường là
helium. Nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu được nâng
lên 3000C để mẫu trở thành dạng khí.
• B. Vỏ ngoài (oven): Phần vỏ của hệ thống GC
chính là một lò nung đặc biệt. Nhiệt độ của lò
này dao động từ 40
0
C cho tới 320
0
C.
• C. Cột (column): Bên trong hệ thống GC là
một cuộn ống nhỏ hình trụ có chiều dài 30
mét với mặt trong được tráng bằng một loại
polymer đặc biệt. Các chất trong hỗn hợp
được phân tách bằng cách chạy dọc theo cột
này.
• Sau khi đi qua cột sắc kí khí, các hóa chất
tiếp tục đi vào pha khối phổ.Ở đây chúng bị
ion hóa.Sau khi khối phổ,chúng sẽ tới bộ
phận lọc
• Dựa trên khối lượng ,bộ lọc lựa chọn chỉ cho
phép các hạt có khối lượng nằm trong một
giới hạn nhất định đi qua.
• Thiết bị cảm biến có nhiệm vụ đếm số lượng
các hạt có cùng khối lượng. Thông tin này
sau đó được chuyển đến máy tínhvà xuất ra
kết quả gọi là khối phổ
• Khối phổ là một biểu đồ phản ánh số lượng các
ion với các khối lượng khác nhau đã đi qua bộ
lọc.

-Máy tính:

Bộ phận chịu trách nhiệm tính toán các tín
hiện do bộ cảm biến cung cấp và đưa ra kết
quả khối phổ.


Công dụng
– Phân tách: GC-MS có thể phân tách các hỗn
hợp hóa chất phức tạp trong không khí hay
trong nước. Ở đây, tốc độ được quyết định
bởi tính bay hơi. Chất nào có tính bay hơi
cao sẽ di chuyển nhanh hơn chất có tính bay
hơi thấp.
– Định lượng: GC-MS có thể định lượng một
chất bằng cách so sánh với mẫu chuẩn, là
chất biết trước và đã được định lượng chuẩn
bằng GC-MS.
• Nhận dạng:
Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất
hiện, khối phổ có thể nhận dạng cấu trúc
hóa học độc nhất của nó. Cấu trúc của
chất này sau đó được so sánh với một
thư viện cấu trúc của các chất đã biết.
Nếu không tìm được chất tương ứng
trong thư viện ,ta thu được một dữ liệu
mới và đóng góp vào thư viện cấu trúc
sau khi tiến hành thêm các biện pháp để
xác định được chính xác loại hợp chất
mới này.


2. Kết hợp sắc ký lỏng đa chiều-khối phổ
liên tiếp (MDLC-MS/MS)

• Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ là
phương pháp được hiểu là mẫu được phân
tách và tinh sạch qua sắc ký, sau đó mẫu được
đưa qua máy khối phổ để tiếp tục xác định
khối lượng nguyên tử của nó.
• Kết thúc quá trình ta thu được lượng mẫu
nhất định và cấu trúc phân tử đó.
Ứng dụng
• Xác định protein
• Kiểm tra chất lượng nông sản, thực phẩn chế
biến, thức ăn gia súc và thủy hải sản: độc tố
nấm mốc, vitamin, thành phần aa, phụ gia
thực phẩm, chất hoạt động bề mặt, dư lượng
kháng sinh (chloramphenicol, nitrofuran,
fluoroquinolone, họ tetracycline,
sulfamide…), dư lượng hormone kích thích
tăng trưởng đã bị cấm, vi sinh vật có hại, mầu
bị cấm trong thực phẩm (các loại Soudan), dư
lượng thuốc trừ sâu.

Điện di kết hợp khối phổ
• Thường được dùng để xác định protein.
Phương pháp này cho phép ta quan sát và
nhận dạng sự hiện diện tất cả các protein ở
các trạng thái tế bào

• Khối phổ là phương pháp mang lại năng suất
và độ chính xác cao trong quá trình nhận biết
những protein đã phân tách bằng điện di 2
chiều.
• Protein được phân tách trên gel
polyacrylamide sau đó được đưa vào máy khối
phổ để phân tích.Các máy móc ngày nay có
thể tự thực hiện các bước phân tích và cho
phép chúng ta quan sát được những protein có
mực độ lớn.

Sequence
database
Tandem mass spectrum
Mass map
Tandem
mass
spectrometry
MALDI
TOF
or
Gel-separated protein
Hình: Xác định protein thu được trong các mẩu sinh học.Protein từ mẩu có thể được
phân tách bằng điện di một hoặc hai chiều và protein được nhận dạng bằng cách sử
dụng MALDI-TOF và đánh dấu khối peptide.Peptide thu được tại những vị trí đặc biệt
của protein đã được phân tách trên gel polyacrylamide có thể được phân tách bằng
cách sử dụng khối phổ tandem.Dữ liệu từ khối phổ tandem có thể được dùng để tạo
nên 1 cơ sở dữ liệu

• Xác định Protein

Có 2 cách chính trong khối phổ để xác định protein.
Lấy dấu khối peptit (PMF) dùng khối của các peptit
đã phân giải làm đầu vào để tìm kiếm trong CSDL
của các khối đã biết trƣớc từ danh sách các protein
đã biết. Nếu một chuỗi protein trong danh sách
tham khảo trùng khớp với giá trị thử nghiệm thì có
lí do để tin rằng protein đó có tồn tại trong mẫu gốc.
Tandem MS đang trở thành một phƣơng pháp thử
nghiệm phổ biến để xác định protein.
• Phân ly do va chạm (CID) đƣợc dùng trong các ứng
dụng chính để khởi tạo một tập các phân mảnh từ
một ion peptit cụ thể. Quá trình phân tách chủ yếu
dựa vào các chế phẩm phân tách để bẻ gãy liên kết
peptit. Vì sự đơn giản của việc phân tách này, nó có
thể dùng khối của các phân mảnh quan sát đƣợc để
so trùng CSDL của các khối đã biết với một hay
nhiều chuỗi peptit.