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Prof. Valmir F.

Juliano

QUI624
INTRODUO AOS MTODOS
CROMATOGRFICOS

Classificao dos mtodos


analticos
CLSSICOS E INSTRUMENTAIS
Chamados de mtodos
de via mida

Gravimetria

Volumetria

Baseados em propriedades
fsicas (qumicas em alguns casos )

Eletroanaltico

Cromatogrfico

Espectromtrico

Propriedades
eltricas

Propriedades
pticas

*Separao: interaes fsico-qumicas.

Propriedades
mistas*

Identificao/quantificao: propriedades pticas ou eltricas.

Cromatografia
Histrico
Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903),
botnico russo: Separao de misturas de pigmentos
vegetais em colunas recheadas com adsorventes slidos e
ter de
solventes variados.
petrleo

mistura de
pigmentos
CaCO3

pigmentos
separados

1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)

Cromatografia
Definio - Princpio Bsico

Cromatografia um mtodo fsico-qumico de


separao de misturas, identificao e
quantificao de seus componentes.

A separao depende da interao dos componentes da


mistura com a fase mvel e com a fase estacionria.

A interao dos componentes da mistura com estas duas fases


influenciada por diferentes foras intermoleculares,
incluindo inica, dipolar, apolar, e especficos efeitos de
afinidade e solubilidade.

A identificao se d mediante a comparao da


interao de padres com as fases estacionrias.
A quantificao feita tambm pela comparao com
padres de concentraes conhecidas, atravs de
curvas analticas.

Cromatografia
Classificao das tcnicas cromatogrficas
De acordo com o sistema cromatogrfico
Em Coluna
Cromatografia Lquida
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Supercrtica
Planar
Centrfuga (Chromatotron)
Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Cromatografia em Papel (CP)

Cromatografia
Classificao das tcnicas cromatogrficas
De acordo com a fase mvel
Utilizao de Gs
Cromatografia Gasosa (CG)
Cromatografia Gasosa de Alta Resoluo (CGAR)
Utilizao de Lquido
Cromatografia Lquida Clssica (CLC)
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)
Utilizao de Gs Pressurizado
Cromatografia Supercrtica (CSC)

Cromatografia
Classificao das tcnicas cromatogrficas
De acordo com a Fase Estacionria
Lquida
Slida
Quimicamente Ligadas
De acordo com o modo de separao

Por Adsoro
Por Partio
Por Troca Inica
Por Afinidade

Cromatografia
Classificao das tcnicas cromatogrficas
Tcnica

Planar

FM

Lquido

FE

Lq

Sl

Coluna

Gs

Lq

Sl

Tipo de
cromato- CP CCD CGL CGS
grafia

Lquido

Lq

Sl

CLL CLS

Troca
Inica

Afinidade

Fase
Ligada

Excluso

CTI

CB

CLFL

CE

Cromatografia
Analogia
O processo cromatogrfico pode ser comparado a um grupo
de abelhas e moscas sobrevoando uma certa regio.
Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre as
moscas e abelhas.

Fase estacionria

Analitos

Cromatografia
Analogia
Para uma mesma mistura, a simples troca da fase
estacionria pode ser suficiente para alterar completamente
a ordem de eluio de componentes da mistura.

Fase estacionria

Analitos

Cromatografia
Princpio Bsico
Separao de misturas por interao diferencial dos seus
componentes com uma FASE ESTACIONRIA (lquido ou
slido) e uma FASE MVEL (lquido ou gs).

Cromatografia
Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se at fazer em casa!
Fase estacionria lquida suportada na celulose.

Fase mvel

Separao

A cromatografia em papel (CP) uma tcnica de partio, utiliza dois lquidos


(lquido-lquido) sendo um fixado em um suporte slido (papel de filtro). Um bom
exemplo a separao da tinta verde. Com o processo de cromatografia possvel
verificar que a cor verde uma mistura de tintura azul e amarela.

Cromatografia
Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se at fazer em casa!

Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, bem


simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na
separao e identificao de compostos polares hidrossolveis.

Cromatografia

Cromatografia de Camada Delgada - CCD


Teve incio em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas comeou a ser
largamente utilizada na ddaca de 1960. O processo de separao est
fundamentado, principalmente, no fenmeno de adsoro. Entretanto com fases
estacionrias tratadas pode ocorrer tambm por partio ou troca inica.

Cromatografia

Cromatografia de Camada Delgada - CCD


Termos e parmetros tcnicos

Smancha
Rf
Ssolvente

s
c
b
a

a
Rfa
s
b
Rfb
s
c
Rfc
s

Cromatografia

Cromatografia de Camada Delgada - CCD

FASES ESTACIONRIAS
Slica (SiO2)
Alumina (Al2O3)

Ativao de 30 a 60 min
de 105 a 110 oC

Celulose
Poliamida

Ativao de 10 min
a 105 oC

Cromatografia

Cromatografia de Camada Delgada - CCD

ANLISE QUALITATIVA
- Comparao com valores de Rf tabelados
- Comparao com padro eludo em conjunto
- Extrao e aplicao de mtodos instrumentais

Cromatografia

Cromatografia de Camada Delgada - CCD

Concluses:
Amostra no contm a espcie B

Amostra pode conter a espcie A

Para se certificar da presena,


eluir em outros solventes
Amostra

A B

Aps
Eluio

Cromatografia

Cromatografia de Camada Delgada - CCD

Cromatografia
Bi-dimensional

Solvente 1

Solvente 2

Cromatografia
Cromatografia planar

Chromatotron uma
cromatografia de camada
fina preparativa acelerada
centrifugamente. Pode
substituir pequenas colunas e
HPLC.

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

PROCESSOS DE SEPARAO
Excluso

Partio

Adsoro

Troca Inica
Afinidade

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

ADSORO
- Fase Mvel Lq. ou Gs
- Fase Estacionria Slida
Processos de
Adsoro/Dessoro
Ligaes de hidrognio;
Foras de Van der Waals

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

Diferena entre Absoro e Adsoro

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

ADSORO
Fase Estacionria Slida:
Polar
Aumento da Atividade
-CO2H > -OH > -NH2 >
-SH > -CHO > -C=O >
-CO2R > -OCH3 > -CH=CH-

Cromatografia

Cromatografia em Coluna
A funo das fases mveis na cromatografia por adsoro
tem sentido amplo:
a) Funo solvente

Solubilizar os componentes
Ter baixo ponto de ebulio

b) Funo eluente

Conduzir os componentes da mistura pela coluna


Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE)

SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente


Hexano < ter de Petrleo < Ciclohexano <

Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno <


Diclorometano < Clorofrmio < ter Etlico <
Acetato de Etila < Acetona < Etanol <
Metanol < cido Actico

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

ADSORO
Usos:
a) Laboratrios de qumica orgnica separar e purificar
reagentes e materiais obtidos em sntese.
b) Laboratrios de produtos naturais escala preparativa
e analtica.
c) Laboratrios de anlises clnicas separao de
esterides de urina ou de sangue, etc.

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

PARTIO
Fase Mvel Gasosa
Fase Estacionria Lquida
Processos de Solubilidade
O processo de partio
intrafacial e a volta de cada
componente para a fase mvel
depende da sua volatilidade.
volatilidade

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

PARTIO
Fase Mvel Lquida
Fase Estacionria Lquida
Processos de Solubilidade
O processo de partio
intrafacial e a volta de cada
componente para a fase mvel
depende da sua solubilidade.
solubilidade

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

TROCA INICA

Por volta de 1935 comearam a ser fabricadas resinas de troca inica


orgnicas, muito eficientes, passando a constituir um meio qumico de
extraordinrio valor em processos analticos.

Fase Mvel Lquida


Fase Estacionria Slida
Processos de Troca Inica
Adsoro reversvel e
diferencial dos ons da fase
mvel pelo grupo trocador
da matriz

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

Fluxo da FM

TROCA INICA

Resinas Catinicas
e Aninicas

FE altamente carregada
Maior Interao
ons de alta carga
ons de menor tamanho
A diferena de afinidade entre
os ons da FM pode ser
controlada por pH e fora inica

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

O ajuste do pH proporciona a separao das duas protenas

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

EXCLUSO
Fase Mvel Lquida
Fase Estacionria em Gel

Enquanto as partculas menores penetram nas


cavidades, as maiores vo sendo eludas
contornando as estruturas moleculares da FE.

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

EXCLUSO
A propriedade que distingue a cromatografia de excluso,
introduzida por volta de 1960, de outros tipos de
cromatografia que o recheio (FE) um gel no carregado
constitudo de macromolculas que tm ligaes cruzadas,
com afinidade pelos solventes, mas que neles so insolveis.

- Separao de tamanhos especficos


- Separao de polmeros e protenas
- Determinao de Massa Molar

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

EXCLUSO
Caractersticas
desejveis para os Gis

-Inrcia Qumica:

No pode haver uma interao


qumica entre a matriz e o soluto.

-Estabilidade:

O gel deve suportar uso contnuo


quanto mantido em condies
brandas de temperatura e pH.

-Baixo teor de ons:

Grupos carregados interferem no


processo de separao.

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

Fluxo da FM

EXCLUSO
Tipos de Gis
Dextrano (Sephadex)
Poliacrilamida
gar e Agarose

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

AFINIDADE
Fase Mvel Lquida
Fase Estacionria Slida
Propriedades
Biolgicas e
Funcionais

Cromatografia
Teoria Bsica

FASE
MVEL

SOLUTO

Sem
importncia
na CG, mas
com grande
importncia
na CLAE

FASE
ESTACIONRIA

Cromatografia
Teoria Bsica
Coluna cromatogrfica:
cromatogrfica srie de estgios independentes onde acontece o
equilbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase estacionria e na fase
mvel:

Ocorre um quase-equilbrio entre o analito


sorvido na FE e dissolvido na FM.

KC

A FE
A FM

KC = Constante de Distribuio
[A]FE = concentrao do analito na FE
[A]FM = concentrao do analito na FM

Afinidade pela FE

[A]FE

MENOR RETENO !!!

Volatilidade

[A]FM

Cromatografia
Quantificao da eficincia
Supondo a coluna cromatogrfica como uma srie de estgios separados
onde ocorre o equilbrio entre o analito, a FE e a FM:

Cada estgio de equilbrio


chamado de PRATO TERICO

O nmero de pratos tericos


de uma coluna (N) pode ser
calculado por:

tR
wb

Coluna mais
eficiente

Cromatografia
Quantificao da eficincia
ALTURA EQUIVALENTE A UM
PRATO TERICO (H)

Tamanho de cada estgio de


equilbrio

Valores tpicos de H e N:

(L = comprimento da coluna)
Capilares, L = 30 m
dc = dimetro da coluna em mm
df = espessura da fase estacionria em m

Empacotadas, L = 2 m

Valores de H para colunas capilares e empacotadas so prximos, mas


como L para capilares MUITO maior tipicamente elas so mais
eficientes

Cromatografia
Cromatografia em fase gasosa
Fase estacionria

Deteco
Fase mvel

Separao

Cromatografia
Cromatografia em fase gasosa
Injetor: submetido
temperatura
controlada
Fase mvel:
gs inerte

Detector:
submetido
temperatura
controlada
Coluna: contendo a
fase estacionria
est submetida
temperaturas
controladas

Cromatografia Gasosa
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser
separadas por CG ?
para uma substncia qualquer poder ser arrastada por um fluxo de
um gs ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gs.

Misturas cujos constituintes sejam


VOLTEIS (=evaporveis)

DE FORMA GERAL:
CG aplicvel para separao e anlise de misturas cujos
constituintes tenham PONTOS DE EBULIO de at 300oC e que
sejam termicamente estveis.

Cromatografia Gasosa
Requisitos - Gs de arraste (FM)
INERTE: No deve reagir com a amostra, nem
com a fase estacionria ou superfcies do
instrumento.
PURO: Deve ser isento de impurezas que
possam degradar a fase estacionria.

Impurezas tpicas em
gases e seus efeitos:
H2O, O2
hidrocarbonetos

oxida / hidrolisa algumas FE


incompatveis com DCE
rudo no sinal de DIC

Cromatografia Gasosa

CUSTO: Gases de
altssima pureza
podem ser muito
caros.

CUSTO

Requisitos - Gs de arraste (FM)

A = 99,995 % (4.5)
B = 99,999 % (5.0)
C = 99,9999 % (6.0)

PUREZA

COMPATVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda


um gs de arraste especfico para melhor funcionamento.
Seleo de Gases de
Arraste em Funo
do Detector:

DCT

He , H2

DIC

N2 , H2

DCE

N2 (SS), Ar + 5% CH4

Cromatografia Gasosa
Injetor
Os dispositivos para injeo (INJETORES ou
VAPORIZADORES) devem prover meios de introduo
INSTANTNEA da amostra na coluna cromatogrfica
t = 0

Injeo instantnea:
t = x
t = 0

Injeo lenta:
t = x

Cromatografia Gasosa
Injetor on column
1
2

1 - Septo (silicone)
3 2 - Alimentao de gs de
arraste)
4

3 - Bloco metlico aquecido


4 - Ponta da coluna
cromatogrfica

Cromatografia Gasosa
Injetor on column

1 - Ponta da agulha
da microsseringa
introduzida no incio
da coluna.
2 - Amostra injetada
e vaporizada
instantaneamente no
incio da coluna.
3 - Plug de vapor
de amostra forado
pelo gs de arraste a
fluir pela coluna.

Cromatografia Gasosa
Parmetros de injeo
TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente
elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem
decomposio.

Regra Geral:
Geral Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulio do
componente menos voltil.

VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado


fsico da amostra.
Slidos:
Slidos
convencionalment
e se dissolve em
um solvente
adequado e
injeta-se a

Amostras
Lquidas

Amostras
Gasosas

empacotada
= 3,2 mm (1/4)

0,2 L ... 20 L

0,1 mL ... 50 mL

capilar
= 0,25 mm

0,01 L ... 3 L

1 L ... 100 L

COLUNA

Cromatografia Gasosa
Microsseringas para injeo
LQUIDOS: Capacidades tpicas: 1 L, 5 L e 10 L
mbolo

agulha (inox 316)

Microsseringa de
10 L:
corpo (pirex)
corpo

agulha

Microsseringa de 1 L
(seo ampliada):
guia
mbolo (fio de ao
soldado ao guia)

Cromatografia Gasosa
Colunas
EMPACOTADA
= 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
Recheada com slido pulverizado
(FE slida ou FE lquida
depositada sobre as partculas do
recheio)
CAPILAR
= 0,1 a 0,5 mm
L = 5 m a 100 m
Paredes internas recobertas com
um filme fino (frao de m) de
FE lquida ou slida

Cromatografia Gasosa
Temperatura da coluna
Alm da interao com a FE, o tempo que um analito demora
para percorrer a coluna depende de sua PRESSO DE
VAPOR (p0).
Estrutura qumica do analito

p0 = f

Temperatura
da
coluna

Temperatura da coluna

Presso
de
vapor

ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE


(MENOR RETENO)
RETENO

Velocidade
de
migrao

Cromatografia Gasosa
Temperatura da coluna

AUMENTO DA
TEMPERATURA DA
COLUNA

CONTROLE CONFIVEL
DA TEMPERATURA DA
COLUNA ESSENCIAL
PARA OBTER BOA
SEPARAO EM CG

Cromatografia Gasosa
Programao linear de temperatura
Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito
diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:
TCOL BAIXA:

TCOL ALTA:

- Componentes mais volteis so


separados

- Componentes mais volteis no


so separados

- Componentes menos volteis


demoram a eluir, saindo como
picos mal definidos

- Componentes menos volteis


eluem mais rapidamente

Cromatografia Gasosa
Programao linear de temperatura
TEMPERATURA

A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a


separao:
TFIM

R
TINI

tINI

Consegue-se boa
separao dos
componentes da
amostra em menor
tempo

TEMPO

tFIM

TINI - Temperatura Inicial


TFIM - Temperatura Final
tINI - Tempo Isotrmico Inicial
tFIM - Tempo Final do Programa
R - Velocidade de Aquecimento

Cromatografia Gasosa

Programao linear de
temperatura
a) Isotrmico a 45 C;
b) isotrmico a 145 C;
c) programado de 30 C a 180 C

Cromatografia Gasosa
Programao linear de temperatura
Possveis problemas associados PLT:
VARIAES DE VAZO
DO GS DE ARRASTE: A
viscosidade de um gs
aumenta com a temperatura.

DERIVA
(DRIFT)
NA
LINHA DE BASE: Devido ao
aumento de volatilizao de
FE lquida

viscosidad
e

vaz
o

Cromatografia Gasosa
Fase Estacionria
REGRA GERAL: a FE deve ter caractersticas tanto quanto possvel
prximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromtico ...)
FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os
componentes da amostra.
FE Seletiva:
separao adequada dos constituintes
da amostra

FE pouco Seletiva:
m resoluo mesmo com coluna de
boa eficincia

Cromatografia Gasosa
Fase estacionria slida
O fenmeno fsico-qumico responsvel pela interao
analito + FE slida a ADSORO
A adsoro ocorre na
interface entre o gs de
arraste e a FE slida

Slidos com grandes reas superficiais


(partculas finas, poros)
ADSORO

Solutos polares
Slidos com grande nmero de stios
ativos (hidroxilas, pares de eltrons...)

Cromatografia Gasosa
Fase estacionria lquida
O fenmeno fsico-qumico responsvel pela interao
analito + FE lquida a ABSORO
A absoro ocorre no interior
do filme de FE lquida
(fenmeno INTRAfacial)

Filmes espessos de FE lquida

ABSORO

Grande superfcie lquida exposta ao gs


de arraste
Interao forte entre a FE lquida e o
analito (grande solubilidade)

Cromatografia Gasosa
Fase estacionria quirais
As propriedades fsico-qumicas dos ismeros ticos so
MUITO SIMILARES FE convencionais no interagem
diferencialmente com os ismeros ticos.
ticos

PRODUTOS BIOLGICOS -

Distino entre produtos de


origem sinttica e natural (natural = normalmente substncias
oticamente puras; sinttico = muitas vezes so misturas racmicas).

FRMACOS -

Em muitos frmacos apenas um dos ismeros ticos


tm atividade farmacolgica.

Cromatografia Gasosa
Detectores
Dispositivos que examinam continuamente o material eludo, gerando sinal
quando da passagem de substncias que no o gs de arraste.

Caractersticas ideais:
ideais
1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.
2.Boa estabilidade e reprodutibilidade.
3.Resposta linear para solutos que se estenda por vrias
ordens de grandeza.
4.Faixa de temperatura desde a ambiente at pelo menos
400 C.
5.Tempo de resposta curto e independente da vazo.
6.Alta confiabilidade e facilidade de uso.
7.Similaridade de resposta para todos os solutos.
8.No destrutivo.

Cromatografia Gasosa
Detectores
REGISTRO
DE
SINAL
ANALGICO
Registradores XY
DIGITAL
Integradores
Computadores

Grfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA

Idealmente: cada substncia separada aparece como um PICO no cromatograma.

Cromatografia Gasosa
Detectores
DCT

UNIVERSAIS:

Geram sinal para


qualquer
substncia eluda.

DCE

SELETIVOS:

Detectam apenas
substncias
com determinada
propriedade
fsico-qumica.

DNP

ESPECFICOS:

Detectam
substncias que
possuam
determinado
elemento
ou grupo funcional
em suas
estruturas

Cromatografia Gasosa
Detectores - Funcionamento

DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA (DCT OU


TCD): Variao da condutividade trmica do gs de arraste.
DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA (DIC OU FID):
ons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de
H2 + ar.
DETECTOR POR CAPTURA DE ELTRONS (DCE OU ECD):
Supresso de corrente causada pela absoro de eltrons por
eluatos altamente eletroflicos.
DETECTOR TERMOINICOS (DNP OU NPD): Modificao
do DIC. Os eluatos queimados na chama H2 + ar passam por
uma superfcie de silicato de rubdio onde se formam ons de
molculas com N e P.

Cromatografia Gasosa
Detectores Limites de deteco

DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA (DCT OU


TCD): Universal.
Universal Observa-se para qualquer substncia eluda.
Sensibilidade: 0,4 a 1 ng com linearidade at dezenas de g (104).

DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA (DIC OU FID):

Quase-universal.
Quase-universal Detecta qualquer substncia que contenha
ligaes C-H. No responde a gases nobres, H2, O2, N2, CX4, SiX4
(X=halognio), CO, CO2, CS2, H2O, NO, N2O, NO2, NH3.
Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade at mg (10 7 108).

DETECTOR POR CAPTURA DE ELTRONS (DCE OU ECD):

Seletivo.
Seletivo Responde muito bem a halogenetos orgnicos, aldedos
conjugados, nitrilas, nitratos e organometlicos. Sensibilidade: 0,01
a 1 pg com linearidade at ng. (104)
DETECTOR TERMOINICO (DNP OU NPD): Especfico.
Especfico
Responde a compostos orgnicos com N e P. Sensibilidade: 0,1 a 1 pg
(P) e 0,4 a 10 pg (N) com linearidade at ng. (103 - 105)

Cromatografia Gasosa
Detectores Espectrometria de massas

CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Especfico.


Especfico Um dos
detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa o
espectrmetro de massas. Observa-se para qualquer substncia
eluda um sinal, mesmo que complexo, no espectrmetro de massa.
seletivo ou especfico quando monitora-se um fragmento de
determinada razo m/z.

Deteco
TIC
Universal
Similar a DCT

SIM
Seletivo
Maior Sensibilidade

Cromatografia Gasosa
Detectores Espectrometria de massas

CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Especfico.


Especfico

CONTAGENS

Cromatograma de ons totais:


TIM ou TIC
Em cada posio do
cromatograma tem-se
um espectro de massa.
CONTAGENS

MASSA / CARGA

TEMPO

Cromatografia Gasosa
Detectores Espectrometria de massas

CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Especfico.


Especfico

MASSA / CARGA

CONTAGENS

Em cada posio do
cromatograma tem-se
o sinal somente da m/z
selecionada.
Oferece a vantagem
de registrar
somente o sinal do
constituinte de
interesse, sendo
cego para os
demais.
demais

CONTAGENS

Cromatograma de ons
selecionados: SIM

TEMPO

Cromatografia Gasosa
Detectores Espectrometria de massas

CG-EM (GC-MS): Interface CG-EM.


CG-EM

EM

CG

Coluna
Capilar

Cmara
de Ionizao

Vcuo
Separador Molecular
O gs de arraste leve
(He) difunde mais
rapidamente que o analito
e tende a ser drenado
para o vcuo.

Interface Capilar Direta


Com colunas capilares a
vazo baixa de gs de
arraste pode ser drenada
pelo sistema de vcuo.

Cromatografia Gasosa
Anlise qualitativa
O parmetro diretamente mensurvel de reteno de um analito o

TEMPO DE RETENO AJUSTADO, tR:


tR

SINAL

tR = tR tM
t
M

TEMPO

tR = Tempo de Reteno (tempo


decorrido entre a injeo e o pice
do pico cromatogrfico)
tM = Tempo de Reteno do
Composto No-Retido (tempo
mnimo para um composto que no
interaja com a FE atravesse a
coluna)
tR = Tempo de Reteno Ajustado
(tempo mdio que as molculas do
analito passam sorvidas na FE)

Cromatografia Gasosa
Anlise qualitativa
Coluna HP-Innowax (PEG altamente polar): 30 m x 0,25 mm x 0,25 m
Detector FID: 250 C
Injetor com diviso de fluxo 1:25: 250 C
Volume injetado: 1 L

Mistura de benzeno, n-propanona,


n-propanol, n-butanol, isobutanol e
n-pentanol.

Como se explica esta


ordem de eluio?

1. A n-propanona elui primeiro


devido sua maior volatilidade.
2. O benzeno em segundo devido
sua natureza apolar (menor ).
3. Para os demais compostos,
cujas diferenas de polaridade
no so elevadas, a volatilidade
se torna o principal parmetro
que define a ordem de eluio.

Cromatografia Gasosa
Anlise quantitativa
O parmetro diretamente relacionado quantidade de analito :

SINAL

Altura da banda cromatogrfica: no recomendado, pois


a banda necessita ser perfeitamente simtrica.
rea da banda cromatogrfica.

rea

TEMPO

Altura

Cromatografia Gasosa

amostra

rea

Anlise quantitativa

Concentrao

tempo

Cromatografia Gasosa
Anlise quantitativa

MASSA

O fim da zona de linearidade pode


ser detectado quando a razo
(rea / Massa) diverge em mais de
5 % da inclinao da reta na
regio linear:

1,05 S

REA / MASSA

REA

A partir de certo
ponto o sinal no
aumenta mais
linearmente

0,95 S
MASSA

Cromatografia Gasosa
concentrao
na amostra
amostra

rea

Anlise quantitativa

Concentrao Adicionada

tempo

Cromatografia Lquida
Cromatografia em fase lquida

Cromatografia Lquida - CLAE


Aplicabilidade
Quais misturas podem ser
separadas por CLAE ?
para uma substncia qualquer poder ser arrastada por um lquido
ela deve dissolver-se nesse lquido.

Lquidos e slidos, inicos ou covalentes com massa molar


de 32 at 4000000.

DE FORMA GERAL:
CL aplicvel para separao e anlise de misturas cujos
constituintes sejam solveis na FM. No h limitao de
volatilidade ou de estabilidade trmica.

Cromatografia Lquida
Aumento de polaridade

Insolvel em gua

Solvel em gua

Apolar
Polar no inico

Tipos e

Partio

Aplicaes da
Cromatografia

102

Adsoro
Massa molecular

Lquida

Inico

103

Partio
em fase
reversa

Partio
em fase
normal

Troca
inica

104

105

106

Permeao
em gel

Excluso

Filtrao
em gel

Cromatografia Lquida
Componentes tpicos - CLAE

Cromatografia Lquida
Esquema de um equipamento para CLAE

Cromatografia Lquida
Requisitos dos sistemas de bombeamento
1 Gerao de presses at 6.000 psi
2 Sada com ausncia de pulsos
3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min
4 Controle e reprodutibilidade de fluxo de
0,5% ou melhor
5 Componentes resistentes corroso

Bomba recproca (tambm so chamadas de


bombas de pisto ou de diafragma)

Cromatografia Lquida
Sistemas de injeo de amostras

Suportam presses de at 7.000 psi


Volumes tpicos: 5 a 500 L
Microamostragem: 0,5 a 5 L

Cromatografia Lquida
Fase mvel para CLAE
Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a
polaridade requerida na separao.
Eluio isocrtica:

Quando a separao feita utilizando um nico solvente de


composio constante.

Eluio com gradiente:


gradiente

So utilizados dois ou trs sistemas de solventes que


diferem bastante entre si em polaridade.
Depois que a eluio comea, a razo entre os solventes
variada de modo programado, de forma contnua ou em
passos.

A eluio com gradiente produz efeitos similares aos


produzidos pela programao de temperatura na CG.

Cromatografia Lquida
Eluio com gradiente

Coluna C18, 5 m, fase reversa


Detector fluorescncia:
excit. 334 nm emis. 425 nm

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Colunas para CLAE
As colunas geralmente so
construdas de ao inox, embora
tubos de vidro com paredes
resistentes sejam encontrados
ocasionalmente. No entanto, estes
ltimos so restritos a presses
mais baixas do que 600 psi.
Existem comercialmente centenas de colunas
empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na fase
estacionria. Preos variam de 200 a 500 dlares.

Cromatografia Lquida
Colunas para CLAE
Remoo de material particulado

Pr-coluna

Contaminantes do solvente
Contaminantes da amostra
Saturar a FM com a FE

Aumenta a vida til da coluna


COLUNAS TPICAS
Material:
Material ao inox
Comprimento:
Comprimento 10 a 30 cm
Dimetro:
Dimetro 4 a 10 mm
FE:
FE Partculas de 5 a 10 m
Eficincia:
Eficincia 40 mil a 60 mil
pratos/metro

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Separao isocrtica de alta velocidade
Coluna de alta
velocidade e
alta eficincia

- 4 cm de comprimento
- 0,4 cm d.i.
- FE: spherisorb 3 m

100.000 pratos/metro

FM: 4,1% EtAc em n-Hexano

1 p-xileno
2- anisol
3- acetato de benzila
4- dioctil-ftalato
5- dipentil-ftalato
6- dibutil-ftalato
7- dipropil-ftalato
8- dietil-ftalato

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Fase estacionria para CLAE
Basicamente so dois tipos de FE:
Pelicular:
Consiste de leitos de polmero ou vidro no-poroso,
esfrico, com dimetros tpicos da ordem de 30 a 40 m,
recoberto com uma camada fina e porosa de:
Slica
Alumina
Resina de poliestireno-divinil-benzeno
Resina trocadora de ons
Partcula porosa:
porosa
Consiste de micropartculas porosas com dimetros de 3
a 10 m. As partculas so constitudas dos mesmos
materiais do recobrimento pelicular.
pelicular

Cromatografia Lquida
Detectores

As caractersticas desejveis para os detectores


para CLAE no so diferentes daquelas para CG.
Existem dois tipos de detectores:
Propriedades universais (ndice de refrao, densidade ou
constante dieltrica).
Propriedades do soluto (absorbncia, fluorescncia, etc).

Caractersticas ideais:
ideais

1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.


2.Boa estabilidade e reprodutibilidade.
3.Resposta linear para solutos que se estenda por vrias ordens de
grandeza.
4.Tempo de resposta curto e independente da vazo.
5.Alta confiabilidade e facilidade de uso.
6.Similaridade de resposta para todos os solutos.
7.No destrutivo.
8.Volume interno mnimo e compatvel com a vazo e com a presso .

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Detectores
Absorbncia
UV/Vis S: 10-9 g/mL FL: 105
IV

Fluorescncia S: 10-9 a 10-12 g/mL FL: 103


ndice de refrao (universal)
S: 10-7 g/mL FL: 104

Cromatografia Lquida
Detectores
Eletroqumicos: existem vrios tipos disponveis atualmente.
Embora no sejam to explorados quanto os detectores
pticos, eles apresentam algumas vantagens como alta
sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade.
Amperomtricos
Coulomtricos
Condutomtricos S: 10-8 g/mL FL: 104
Polarogrficos S: 10-12 g/mL FL: 106

Cromatografia Lquida
Detectores

Espectrometria de massa - universal


Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrmetro de massa
potencializa a tcnica de separao e quantificao
Um grande problema o descompasso entre os volumes relativamente
grandes de solventes na CL e os requisitos de vcuo na EM.
Interface CL-EM

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Detectores

Espectrometria de massa

SIM
CONTAGENS

CONTAGENS

TIC

CONTAGENS

CONTAGENS

MASSA / CARGA

MASSA / CARGA

TEMPO
TEMPO

Cromatografia Lquida
Tipos de CLAE
Ao contrrio da CG, onde a FM se comporta como
um gs ideal e no contribui para o processo de
separao, a FM lquida da CLAE interage tanto
quanto a FE com os componentes da amostra.
Isto torna o desenvolvimento dos mtodos em
CLAE um tanto mais complexo que na CG.

Cromatografia Lquida
Tipos de CLAE
PARTIO:
PARTIO lquido-lquido e fase ligada. A diferena entre
elas consiste em como a FE mantida nas partculas do
suporte do empacotamento Adsoro e ligao qumica.
qumica
Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase
reversa.
reversa
Fase normal: FE de natureza fortemente polar (ex. gua)
FM apolar (ex. hexano ou ter isoproplico)
O componente menos polar eludo primeiro por ser o
mais solvel na fase mvel.
Fase reversa: FE de natureza apolar (ex. hidrocarbonetos)
FM polar (ex. gua, metanol ou acetonitrila)
O componente mais polar aparece primeiro e o aumento
da polaridade da fase mvel aumenta o tempo de eluio.

Cromatografia Lquida
Tipos de CLAE
provvel que de toda a CLAE esteja baseada na fase
reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses
recobrimentos uma cadeia C8 (n-octil) ou C18 (n-octadecil)

Cromatografia Lquida
Tipos de CLAE
Campo

Misturas tpicas

Farmacutico

Antibiticos, sedativos, esterides,

Bioqumico

analgsicos
Aminocidos, protenas, carboidratos, lipdios

Produtos alimentcios

Adoantes artificiais, antioxidantes,

Produtos qumicos

aflatoxinas, aditivos
Aromticos condensados, surfactantes,

Poluentes

propelentes, corantes industriais


Pesticidas, herbicidas, fenis, PCB (bifenilas

Qumica forense

policloradas)
Drogas txicas, venenos, lcool no sangue,

Clnica mdica

narcticos
cidos de blis, metablitos de drogas,
extratos de urina, estrgenos

Cromatografia Lquida
Tipos de CLAE
ADSORO:
ADSORO lquido-slido. FE slica ou alumina.
alumina a forma
clssica da CL introduzida no incio do sculo 20. Sofreu
adaptaes e tornou-se o mais importante dos mtodos de
HPLC.
TROCA INICA:
INICA lquido-slido. FE resina com capacidade
de troca inica.
inica
EXCLUSO:
EXCLUSO lquido-gel. FE gel.
gel Um material polimrico,
hidrofbicos ou hidroflicos, com muitas ligaes cruzadas,
so capazes de promover a separao de acordo com os
tamanhos das molculas EXCLUSO DE TAMANHO.
TAMANHO Se o
material reticulado for uma resina de troca inica, tem-se a
cromatografia de EXCLUSO DE ONS.
ONS

Cromatografia

Para refletir e responder:


Duas substncias diferentes com a mesma concentrao
apresentaro a mesma rea sob suas bandas cromatogrficas?
Para um mesmo analito, a rea ou altura aumentam
com o aumento da concentrao. A rea sob a banda
cromatogrfica de duas substncias diferentes
depender da resposta do detector para aquele tipo
de substncia, independentemente do tipo de
detector utilizado.

Cromatografia

Para refletir e responder:


A CG pode ser usada indistintamente para qualquer tipo de
analito?
A CL til quando a CG no pode ser usada. Quais so os
casos em que isto ocorre?

FIM