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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAU

CENTRO DE CINCIAS DA SADE


DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA E FARMACOLOGIA
CURSO DE FARMCIA

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA

TERESINA, 2013

Nas
indstrias
qumicas,
farmacuticas,
alimentcias, refinarias, petroqumicas, laboratrios
de anlises clnicas, ambiental e forense entre
outras, frequentemente necessrio separar,
isolar, purificar, identificar e quantificar os
componentes de misturas muitas vezes bastante
complexas.

IMPORTNCIA DA CROMATOGRAFIA
Velocidade
Poder de resoluo
Manuseio

de pequenas
amostra (10-9 10-15g)

Simplicidade da tcnica

quantidades

de

VISO GERAL DE CROMATOGRAFIA


O objetivo da cromatografia separar individualmente os

diversos constituintes de uma mistura de substncias seja


para identificao, quantificao ou obteno da substncia
pura para os mais diversos fins.

Tal separao d-se atravs da migrao da amostra atravs

de uma fase estacionria por intermdio de um fluido (fase


mvel).

Aps a introduo da amostra no sistema cromatogrfico, os

componentes da amostra se distribuem entre as duas fases e


viajam mais lentamente que a fase mvel devido ao efeito
retardante da fase estacionria.

O equilbrio de distribuio determina a velocidade com a qual

cada componente migra atravs do sistema.

DESCRIO GERAL
DE HPLC
A amostra dissolvida em um solvente apropriado

e introduzida na coluna cromatogrfica preenchida


com a fase estacionria (FE)
Um solvente (FM) bombeado com vazo
constante e desloca os componentes da mistura
atravs da coluna. Esses se distribuem entre as
duas fases de acordo com suas afinidades
As substncias com maior afinidade com a FE
movem-se mais lentamente. J as substncias com
pouca afinidade com a FE movem-se mais
rapidamente.
Ao sair da coluna, os componentes passam por um
detector que emite um sinal eltrico o qual
registrado, constituindo um cromatograma.

COMPARATIVO HPLC / CG

INSTRUMENTAO EM HPLC
DIAGRAMA DE UM CROMATGRAFO A
LQUIDO

O cromatgrafo a lquido constitudo dos seguintes


componentes:
1.
2.
3.
4.
5.

Reservatrio e sistema de bombeamento da fase mvel


Sistema de introduo de amostra
Sistema analtico: coluna cromatogrfica e termostato
Sistema de deteco (um ou mais detectores)
Sistema de registro e tratamento de dados.

DIAGRAMA DETALHADO DE UM
HPLC

FOTO ILUSTRATIVA DE UM HPLC

RESERVATRIO DA FASE MVEL

CONSIDERAO IMPORTANTE 1:
A fase mvel no pode conter partculas para

evitar danos bomba, injetor e coluna, logo


necessrio filtrao antes de armazenar a
fase mvel no reservatrio.

A escolha do filtro funo da natureza da


fase
mvel.
Usualmente
utiliza-se
membranas de nylon (0,20 e 0,45 m),
celulose (0,22 m ) ou TEFLON (1 e 1,5 m)

CONSIDERAO IMPORTANTE 2:
A fase mvel deve ser degaseificada para evitar a

formao de bolhas no processo de separao o


que pode interferir no desempenho da anlise.

As tcnicas de degaseificao so:


Ultrasom
Refluxo com resistncia de aquecimento
Vcuo (trompa dgua)
Purga com Hlio
Uso de membrana semipermevel e vcuo online.

BOMBA
CARACTERSTICAS PRINCIPAIS
Leva a fase mvel desde o reservatrio at a

coluna
Alta reprodutibilidade e exatido
Vazo contnua sem pulso de 0,01ml /min 10ml /min
Vazo
constante
independentemente
da
presso
Alta resistncia corroso inrcia qumica a
solventes comuns
Opera a altas presses (6000 psi)

CONSIDERAES IMPORTANTES
Vazo constante essencial para qualquer separao por

HPLC. Alta presso necessria para impulsionar o


solvente atravs da coluna cromatogrfica vencendo a
enorme resistncia imposta pela fase estacionria.

Preferencialmente devem operar com programao de

vazo e deve ser possvel a interrupo do processo em


presses fora dos limites mximos e mnimos prestabelecidos.

importante introduzir fatores de correo de


compressibilidade para a fase mvel utilizada ainda que os
lquidos tenham baixa compressibilidade. Caso contrrio, a
vazo real pode diferir da selecionada.

BOMBEAMENTO ISOCRTICO OU POR


GRADIENTE
BOMBEAMENTO ISOCRTICO
A composio da fase mvel mantida constante
durante toda anlise cromatogrfica.
Nesse caso utiliza-se apenas uma bomba.
A figura abaixo ilustra o equipamento necessrio
para uma anlise isocrtica.

BOMBEAMENTO POR GRADIENTE


Alguma anlises necessitam alterao da composio da

fase mvel, sem alterao da vazo total, com a


finalidade de diminuir tempo de anlise e/ou melhorar a
separao dos componentes da amostra.

O bombeamento por gradiente pode ocorrer baixa

presso ou a alta presso.

No caso de baixa presso utiliza-se uma nica bomba e

a seleo do solvente a ser utilizado d-se atravs de


vlvula de mltiplas vias controladas pelo software do
sistema.

J no caso do bombeamento de alta presso, cada

solvente tem uma bomba especfica.

A figura ilustra o equipamento necessrio para o a

anlise por gradiente a baixa e alta presso.

INJETOR
SISTEMA DE INTRODUO DE
AMOSTRA
Em HPLC, a injeo de amostra realizada com auxlio de vlvulas
especiais que permitem introduo com grande preciso e exatido de
volumes que variam, em geral, de 5 a 20l. A figura abaixo, mostra
um esquema de uma vlvula tpica nas posies de carga e de injeo.

A amostra introduzida na vlvula com auxlio de uma microseringa com


agulha sem ponta e a injeo efetuada pela rotao da vlvula da
posio de carga para a posio de injeo.

COLUNAS CROMATOGRFICAS
COLUNAS ANALTICAS E PRECOLUNAS
A separao efetuada nas colunas cromatogrficas, feitas em

ao e resistentes a altas presses(at 500 atm)

Os tubos das colunas so preenchidos com a fase estacionria

conveniente, geralmente slica ou seus derivados, com


granulometria de 3, 5, 7 ou 10 m (em alguns casos, at de1 m)
de dimetro mdio.

Devido a queda de presso elevada nos tubos, as colunas so

relativamente curtas e de paredes espessas.

COMPRIMENTO: 3 60 cm
DIMETRO INTERNO: 0,2 8 mm
As colunas normais apresentam dimetro interno variando de 4

6 mm e comprimento que depende da granulometria da fase


estacionria como mostra a tabela abaixo.

COLUNAS CROMATOGRFICAS
COLUNAS ANALTICAS CONSIDERAES
IMPORTANTES:
Como o tempo de reteno depende da temperatura,

as colunas devem ser mantidas termostatizadas em


um forno onde pode-se selecionar a temperatura
apropriada para a separao.
Para reduzir os custo dos solventes e aumentar sua

eficincia, esto sendo introduzidas colunas de


dimetro interno de 1 3 mm, de forma que possa
operar-se com fluxos menores o que resulta em
diminuio substancial do custo de operao e
aumento de sensibilidade como ilustrado na figura
abaixo.

PR-COLUNAS (GUARD COLUMNS)


SEMPRE USE PR-COLUNAS PARA PROTEGER E AUMENTAR A VIDA DA
COLUNA ANALTICA
CARACTERSTICAS PRINCIPAIS:
Protege a coluna analtica contra contaminaes qumicas
Mesmo material de empacotamento da coluna
Comprimento Tpico: 25 mm
Descartveis

O uso

de pr-colunas de importncia vital para a vida til da coluna analtica.


A filtrao da fase mvel e da amostra nem sempre so suficientes para a
eliminao de impurezas prejudiciais coluna.
Pode acontecer reteno irreversvel, ou seja, a afinidade do contaminante
pela coluna to grande que ele no elui, ficando retido nos primeiros
centmetros do empacotamento. pode provocar perda da eficincia, aumento
de presso e cauda nos picos. Com o uso da pr-coluna, o contaminante no
atingir a coluna analtica.
Ao perceber os sintomas de contaminao (os mais comuns so aumento de
presso e elevao no nvel de rudo), substitui a pr-coluna, que em mdia
custa 10 vezes menos que a coluna analtica.

DETECTORES
O detector um dispositivo conectado na sada da

coluna que percebe a presena de componentes e


emite um sinal eltrico a ser registrado na forma de
um pico cuja rea proporcional a quantidade do
componente analisado.
Um detector ideal deve possuir as seguintes caractersticas:
Alta Sensibilidade
Estabilidade: Mudanas de temperatura e vazo de fase mvel
no devem alterar o sinal
Reprodutibilidade
Resposta Linear: A resposta do detector deve variar linearmente
com a concentrao do analito numa extensa faixa de concentrao
Resposta rpida aos analitos
No contribuir para o alargamento do pico
Confiabilidade
Facilidade de manuseio
No destrutivo
Condio necessria para cromatografia preparativa
Seletividade
Habilidade relativa de um detector medir um composto e no outro.

TIPOS DE
DETECTORES
Os principais detectores utilizados em HPLC so:
ndice de refrao
Espectrofotometria UV-Visvel
Fluorescncia
Eletroqumico
Espectrometria de massa LC/MS

NDICE DE
REFRAO

No momento da passagem do analito pelo detector, pode ocorrer

uma alterao do ndice de refrao. Essa alterao em relao


ao valor da fase mvel livre de analito detectada.

A deteco s possvel quando o ndice de refrao do analito

diferente do IR da fase mvel.

Esse detector normalmente utilizado quando os analitos no

absorvem na regio de comprimento de onda do UV-VIS.

Apresenta as seguintes desvantagens:


baixa sensibilidade
no permite a utilizao em anlises por gradiente (pois o IR varia
com a composio da fase mvel)
temperatura deve ser constante (pois o IR varia com a
temperatura)
APLICAO
Anlises de carbohidratos e acares em geral.

ESPECTROFOTMETRO UV-Visvel (UVVIS)


Baseia-se na absorbncia da luz pelo analito ao passar pelo

detector.
um detector seletivo pois s detecta os compostos que absorvem
no comprimento de onda em que o detector for ajustado.
o detector mais utilizado em HPLC pois grande maioria das
substncias absorvem radiao UV. Exemplos de substncias so:
olefinas, aromticos, compostos contendo ligaes C=O, C=S, N=O.
CONSIDERAES IMPORTANTES:
A fase mvel utilizada no pode absorver no comprimento de onda

selecionado
A pureza da fase mvel extremamente importante (traos de
impurezas podem absorver intensamente no comprimento de onda
utilizado): UTILIZAR SOLVENTES GRAU HPLC

TIPOS DE DETECTORES UV-VIS:


Fotomtricos comprimento de onda fixo: 254nm e 280nm
Espectrofotomtricos comprimento de onda varivel:

a190nm

00nm

DETECTORES ELETROQUMICOS
Baseia-se na possibilidade de muitos compostos serem

oxidados ou reduzidos quando se aplica um potencial


eltrico.
Em um processo eletroqumico, um par de eletrodos
colocado na cela e um potencial suficientemente elevado
aplicado provocando uma reao de oxidao ou reduo
gerando uma corrente que medida em um detector
eletroqumico. A corrente gerada proporcional a
concentrao do composto.
TIPOS DE DETECTORES
Amperomtrico
O elemento flui pela superfcie do eletrodo onde uma frao das

espcies eletroativas oxidada ou reduzida (15-20%).

Coulomtrico
O elemento flui atravs de um eletrodo de grafite poroso onde
praticamente 100% das espcies eletroativas so oxidadas ou
reduzidas e portanto a sensibilidade muito maior (10-15mol =
fentomol)

AQUISIO DE DADOS
Atualmente

utilizam-se

softwares

que

permitem:
Processar os dados de cromatograma
Armazenar e registrar
Controlar

a composio da fase mvel


(isocrtica e por gradiente), vazo da bomba,
amostrador automtico, temperatura da coluna

PARMETROS CROMATOGRFICOS
Uma

srie de parmetros cromatogrficos so


importantes para serem utilizados na identificao dos
compostos
separados,
avaliar
o
desempenho
cromatogrfico e auxiliar na otimizao do processo de
separao.

Os parmetros cromatogrficos a serem considerados

so:
TEMPO DE RETENO
FATOR DE SEPARAO
NMERO DE PRATOS
RESOLUO

TEMPO DE RETENO
Por

definio
chamamos
de
TEMPO
DE
RETENO, (tr), de uma substncia ao tempo
decorrido do instante em que a amostra foi
introduzida at o instante do mximo do pico.

Na anlise cromatogrfica, mantido


constantes a vazo da fase mvel e a
temperatura da coluna, o tempo de
reteno constante.

NMERO DE PRATOS
Nmero indicativo da performance da coluna. a

medida da largura do pico em relao ao seu tempo


de reteno. o parmetro que mais precisamente
define a qualidade de um sistema cromatogrfico.

RESOLUO
Fornece uma medida quantitativa da habilidade

da coluna em separar duas substncias.

FASE MVEL
ESCOLHA DO SOLVENTE EM HPLC
O sucesso da separao cromatogrfica s possvel se

for aplicada uma FM correta a uma FE conveniente.

A escolha da composio da FM leva em conta vrios

fatores, tais como:

Propriedades fsico-qumicas que afetam a solubilidade,

partio e adsoro e, portanto, a separao


Propriedades fsicas que afetam a possibilidade de
deteco dos componentes
Propriedades fsicas que dificultam o manuseio das
bombas, detectores e coluna
Propriedades que afetam a segurana (toxicidade e
inflamabilidade)
Custo

SELEO DA FM NO DESENVOLVIMENTO
DO MTODO ANALTICO

ANLISE QUALITATIVA
A anlise qualitativa em HPLC tem por objetivo

a identificao dos analitos de interesse.


Existem dois casos a serem considerados para

anlise qualitativa com HPLC:


Anlise Qualitativa em Controle de qualidade
Anlise Qualitativa em identificaes no rotineiras

Anlise Qualitativa em Controle de qualidade


normalmente efetuada atravs da comparao do
tempo de reteno ou reteno relativa dos analitos
de interesse com esses parmetros de padres. Tais
anlises so realizadas com metodologias j
estabelecidas.
fundamental o controle e monitoramento das
condies analticas para evitar concluses errneas.
Anlise

qualitativa em identificaes no
rotineiras
Neste caso importante conhecer o mximo da

histria da amostra e utilizar detectores que


auxiliam a identificao da estrutura do composto,
como detector de espectrometria de massa.

DESENVOLVIMENTO DE MTODO HPLC


COM AUXILIO DE COMPUTADOR
Vrios softwares foram desenvolvidos com o objetivo de auxiliar no

desenvolvimento de mtodo de anlise por HPLC.


So softwares caros, mas o investimento permite uma economia para
as Empresas, pois cada mtodo desenvolvido em pouco tempo.
Dependendo da experincia em cromatografia e da complexidade da
amostra,
um
mtodo
desenvolvido
manualmente
(mtodo
convencional), pode levar um ms ou mais.
Com um desses programas eletrnicos, o mtodo pode ser
desenvolvido em algumas horas ou poucos dias.
ALGUNS PROGRAMAS BEM CONHECIDOS E DOCUMENTADOS:
DRY-LAB
2000
PLUS
(Rheodyne)

www.molnarinstitut.com/www.rheodyne.com
CHROMSWORD AUTO - (Hitachi Agilent Iris) www.chromswordauto.com
ACD LABS METHOD DEVELOPMENT SOFTWARE www.acdlabs.com
POPLC- Phase Optimized Liquid Chromatography BISCHOFF
CHROMATOGRAPHY www.poplc.def