DETEKSI DNA

Metode Analisis
Kualitatif

dan elektroforesis isoenzim. ukuran dan bentuk setiap molekul yang terlibat. Kecepatan migrasinya tergantung pada muatan. Metode elektroforesis gel agarosa merupakan metode yang paling umum (konvensional) yang dapat digunakan untuk menganalisis asam nukleat.Analisis Kualitatif Elektroforesis Elektroforesis adalah proses migrasi molekul bermuatan di dalam media yang bermuatan listrik. Kecapatan molekul untuk bermigrasi: molekul kecil > molekul besar Terdapat beberapa jenis elektroforesis yang telah dapat digunakan untuk menganalisis makromolekul termasuk asam nukleat. elektroforesis gel poliakrilamida. Perbedaan molekul menyebabkan terjadinya pemisahan. Beberapa diantaranya adalah elektroforesis gel agarosa. . Elektroforesis biasanya menggunakan gel sebagai tempat untuk migrasi molekul. elektroforesis gel 2D.

.

.

STAINING  Metode staining digunakan untuk visualisasi DNA setelah diseparasi oleh gel elektroforesis. beberapa diantaranya adalah etidium bromida. SYBR Safe. SYBR Gold.Terdapat banyak jenis pewarna yang dapat digunakan keperluan ini. dan Eva Green. . SYBR Green.

Ada dua metode yang dapat digunakan untuk mengurutkan molekul DNA.SEQUENCING   Sequencing adalah penentuan urutan basa DNA dalam segmen molekul DNA yang relatif pendek Pengurutan (sequencing) asam nukleat memungkinkan kita mengetahui kode genetik dari molekul DNA. . Metode MaxamGilbert dan metode Sanger.

biasanya menggunakan fosfat radioaktif atau suatu nukleotida pada ujung 3’. Pada metode ini fragmen-fragmen DNA yang akan disekuens harus dilabeli pada salah satu ujungnya. basa dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu.M. ujung C atau T. Gilbert pada tahun 1977. akan dihasilkan empat macam fragmen. masing-masing dengan ujung G. Maxam dan W. asam format menyerang A dan G. . Selanjutnya.METODE MAXAM GILBERT   Metode sekuensing DNA yang pertama dikenal adalah metode kimia yang dikembangkan oleh A. ujung A atau G. hidrazin akan menghidrolisis C dan T. Pengaturan masa inkubasi atau konsentrasi piperidin akan menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang bermacammacam ukurannya. Dengan demikian. tetapi garam yang tinggi akan menghalangi reaksi T sehingga hanya bekerja pada C. Molekul DNA terlebih dahulu dipotong-potong secara parsial menggunakan piperidin. dan ujung C. Metode MaxamGilbert dapat diterapkan baik untuk DNA untai ganda maupun DNA untai tunggal dan melibatkan pemotongan basa spesifik yang dilakukan dalam dua tahap. Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G.

maka polimerisasi lebih lanjut tidak akan terjadi atau terhenti. pada masing-masing reaksi juga ditambahkan sedikit ddNTP sehingga kadang-kadang polimerisasi akan terhenti di tempat -tempat tertentu sesuai dengan ddNTP yang ditambahkan. di dalam tiap reaksi akan dihasilkan sejumlah fragmen DNA yang ukurannya bervariasi tetapi ujung 3’nya selalu berakhir dengan basa yang sama. Sekuensi DNA menggunakan metode dideoksi dilakukan pada empat reaksi yang terpisah. Kedua sifat tersebut adalah kemampuannya untuk menyintesis DNA dengan adanya dNTP dan ketidakmampuannya untuk membedakan dNTP dengan ddNTP. jika ddNTP disambungkan oleh fragmen klenow dengan suatu molekul DNA. . Artinya.METODE SANGER   Metode Sanger pada dasarnya memanfaatkan dua sifat salah satu subunit enzim DNA polimerase yang disebut fragmen klenow. Namun. Jika molekul dNTP hanya kehilangan gugus hidroksil (OH) pada atom C nomor 2 gula pentosa. Jadi. Basa yang terdapat pada ujung molekul DNA ini dengan sendirinya adalah basa yang dibawa oleh molekul ddNTP. Keempat reaksi ini berisi dNTP sehingga polimerisasi DNA dapat berlangsung. molekul ddNTP atau dideoksi nukleotida juga mengalami kehilangan gugus OH pada atom C nomor 3 sehingga tidak dapat membentuk ikatan fosfodiester.

untuk membentuk konfigurasi urutan ganda. Hibridisasi (molecular probe) bertujuan untuk mengidentifikasi atau untuk mengetahui lokasi dari beberapa asam nukleat dalam susunan gen pada makhluk hidup.METODE HIBRIDISASI     Hibridisasi asam nukleat adalah proses dimana 2 DNA atau RNA rantai tunggal yang berasal dari sumber induk yang berbeda. . Hibridisasi dapat dilakukan dengan pasangan DNA-DNA. RNA-RNA or DNA-RNA. Urutan nukleotida yang berasal dari 2 induk yang berbeda bersifat komplementer.

Ilustrasi tahapan metode Southern Blotting Metode ini digunakan untuk memindahkan protein DNA ke suatu pengangkut sehingga dapat dipisahkan. forensik dan diagnostik. Dalam tingkat genetik untuk memodifikasi pada organisme. DNA sampel sebelum atau setelah pencernaan enzim restriksi dipisahkan dengan elektroforesis gel dan kemudian ditransfer ke membran dengan blotting melalui aksi kapiler. dan sering juga diikuti penggunaan suatu gel elektroforesis. . Southern blot berkombinasi dengan elektroforesis gel agarosa untuk separasi ukuran DNA. Gambar 6.SOUTHERN BLOTTING     Southern Blotting adalah metode untuk menganalisis urutan DNA tertentu dalam sampel DNA. Membran tersebut kemudian dikenakan probe DNA berlabel yang memiliki urutan basa pelengkap untuk urutan DNA sampel. evolusi dan studi pengembangan. blot analysis bermanfaat untuk mengidentifikasi bentuk berbeda. menentukan memasukkan atau menyisipkan jumlah salinan danuntuk mendeteksi jumlah penyusunan DNA yang mengalami perubahan. Southern blotting digunakan untuk penemuan gen dan pemetaan DNA.

.

Langkah pertama dari metode ini adalah denaturasi atau pemisahan RNA di dalam sampel menjadi rantai tunggal. Pada dasarnya metode ini adalah kombinasi dari denaturasi RNA elektroforesis gel dan staining. Selanjutnya molekul RNA dipisahkan berdasarkan ukuran melalui metode gel elektroforesis. DNA atau RNA yang digunakan pada proses ini dipastikan harus memiliki urutan yang sesuai dengan urutan sampel. namun hasil yang paling dalam penyataan band yang mewakili ukuran RNA terdeteksi dalam sampel. Hal ini memastikan bahwa rantai RNA tidak dalam posisi terlipat dan tidak terdapat ikatan diantara rantai molekul. probe dapat terhibridisasi atau terikat pada pecahan RNA di membran. . Dalam proses ini RNA dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke membran yang kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel urutan kepentingan. Intensitas band-band ini berkaitan dengan jumlah RNA target dalam sampel yang dianalisis. RNA ditransfer dari gel ke blot membran. Dengan begitu. probe mengizinkan molekul RNA yang diinginkan dapat terdeteksi diantara molekul RNA lainnya pada membran. Setelah hibridisasi. Prosedur ini umumnya digunakan untuk mempelajari kapan dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi dengan mengukur berapa banyak RNA hadir dalam sampel yang berbeda. Setelah pemisahan. Hasilnya dapat digambarkan melalui berbagai cara tergantung pada label yang digunakan. Setelah itu membran dilalui proses probe.NORTHERN BLOTTING   Northern Blotting digunakan untuk menganalisis urutan RNA (RNA sequence) tertentu diantara kumpulan molekul RNA.

.

yang berjarak sempit. Salah satu contoh Microarrays adalah Microarray DNA atau gene chip. difikasasi ke kaca objek dalam array.Analisis Kuantitatif Microarray  Microarray adalah salah satu metode untuk meneliti ekspresi seluruh genom. Microarray DNA terdiri dari berbagai macam fragmen DNA beruntai tunggal dalam jumlah sedikit merepresentasikan gen yang berbeda-beda. atau kisi-kisi. .

.  Metode ini dapat menguji ribuan gen secara bersamaan untuk menentukan gen mana yang diekspresikan dalam jaringan tertentu. berbagai penyakit. ataupun tahap perkembangan yang berbeda. Metode ini dapat menguji ribuan gen secara bersamaan untuk menentukan gen mana yang diekspresikan dalam jaringan tertentu. lingkungan yang berbeda. berbagai penyakit. ataupun tahap perkembangan yang berbeda. lingkungan yang berbeda.

.

Dikatakan PCR lebih cepat karena metode ini mampu membuat miliaran salinan segmen sasaran DNA dalam waktu beberapa jam. Dalam teknik ini. Ibaratnya PCR bagaikan memfotokopi satu halaman saja. bukan memeriksa setiap buku dalam perpustakaan.PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)  PCR adalah suatu metode untuk memperbanyak DNA secara in Vitro saat sumber DNA hanya sedikit atau tidak murni. segmen sasaran spesifik apapun dalam satu atau lebih molekul DNA dapat diperbanyak berkali-kali. PCR mempunyai kelebihan yaitu lebih cepat dan lebih efektif. tidak seperti metode pustaka DNA. .

. Tahap-tahap PCR  Denaturasi  Pada tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu 94 oC yang menyebabkan terjadinya pemisahan untai ganda DNA menjadi untai DNA tunggal. Untai DNA tunggal inilah yang menjadi cetakan bagi untai DNA baru yang akan dibuat.

DNA yang pendek ini disebut primer. .  Penempelan (Annealing) Enzim Taq polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA baru jika ada seuntai DNA berukuran pendek (DNA yang mempunyai panjang sekitar 10 sampai 30 pasang basa) yang menempel pada untai DNA target yang telah terpisah. diperlukan suhu yang rendah sekitar 55 0C selama 30-60 detik. Agar suatu primer dapat menempel dengan tepat pada target.

DNA cetakan dan nukleotida. penempelan dan pemanjangan untai DNA menjadi untai DNA yang baru. . 2000). maka untai DNA yang baru dibentuk akan kembali mengalami proses denaturasi. et al. Pengulangan proses PCR akan menghasilkan amplifikasi DNA cetakan baru secara eksponensial (Marks Dawn. Ketika tiga tahap di atas dilakukan pengulangan.. enzim DNA polymerase akan memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan antara primer.   Pemanjangan (Ektension) Setelah primer menempel pada untai DNA target.

. Real Time PCR memungkinkan dilakukannya deteksi dan kuantifikasi (sebagai nilai absolut dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah relatif setelah dinormalisasi terhadap input DNA atau gen-gen penormal yang ditambahkan) sekaligus terhadap sekuens spesifik dari sampel DNA yang dianalisa.REAL TIME PCR   Real Time PCR adalah suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut.

keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi dari probe (penanda). Pada Real Time PCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforesis. sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan Ethidium Bromide (EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik.  Analisa menggunakan Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung. .

EtBr dapat diberikan pada setiap sampel yang akan dimasukkan ke sumuran gel atau dicampurkan ke gel agarosa sebelum gel dicetak dalam cetakan gel.50 sampai 20 ug/mL. arus listrik dan temperatur. konsentrasi agarosa. Pewarna Ethidium Bromide (EtBr) digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur semi-kualitatif fragmen DNA yang terseparasi dalam gel. dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.0. Intensitas fluoresence dapat diukur dengan menggunakan DNA marker standar. separasi dan purifikasi fragmen DNA adalah menggunakan elektroforesis gel agarosa.SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS  Uji kuantitatif DNA dengan spektrofotometri UV-Vis. sehingga dapat diperkirakan kuantitas DNAnya. . Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor ukuran dan konformasi molekul DNA. karena pewarna ini mengandung zat fluoresence. misal antara 0.8-2. sedang kontaminan protein atau phenol akan menyerap cahaya pada λ 280 nm. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada λ 260 nm. sehingga band/pita DNA dalam gel agarosa akan berpendar. Serta untuk mengukur konsentrasi DNA digunakan rumus sebagai berikut:  Metoda standar yang digunakan untuk identifikasi. Sehingga kemurnian DNA dapat dukur dengan menghitung nilai absorbansi λ 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi λ 280 (Å260/Å280). DNA murni dapat menyerap cahaya ultraviolet karena keberadaan basa-basa purin dan pirimidin. EtBr ini akan terikat diantara dua untai ganda DNA.