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Staphylococcus

Dra. Elsa Masae Mamizuka


USP
Dr. Antnio Carlos Pignatari
Diretor do Laboratrio Especial de Microbiologia LEMC

Introduo a cocos Gram-positivos


Caractersticas do Gnero Staphylococcus
Staphylococcus aureus
Enzimas Extracelulares
Testes de aglutinao rpida para coagulase
Padres de Hemlise
Regulao de Fatores de Virulncia
Staphylococcus epidermidis
Outras espcies de Staphylococcus
Identificao simplificada dos cocos Gram positivo de importncia clnica
Chave Geral para a Identificao de Staphylococcus
Staphylococcus saprophyticus
Deteco de resistncia de Staphylococcus aureus oxacilina e ou vancomicina
Resistncia aos Antibiticos
Staphylococcus aureus resistente oxacilina-ORSA
Mtodos laboratoriais para a deteco da resistncia oxaclina ( meticilina)
Resistncia Vancomicina
Deteco da VISA/VRSA
Relao de drogas testadas para Staphylococcus aureus e relatadas no antibiograma

ndice

Introduo a cocos Gram-positivos

Os cocos Gram positivos (CG+) compem um


grupo de grande importncia clnica. So
responsveis por inmeras e variadas
afeces e sndromes.
Os CG+ anaerbios facultativos de
importncia clnica pertencem a uma de
duas famlias:
Micrococcaceae ou Streptococcaceae

Pesquisa de catalase na bactria

Introduo a cocos Gram-positivos

A partir da caracterizao da amostra como


CG+ atravs da colorao de Gram, a
determinao da famlia feita pela prova da
catalase.
A prova da catalase consiste em colocar
uma amostra de bactria em contato com o
perxido de hidrognio, e pesquisar a
formao de bolhas de oxignio.

2H2O2

catalase

2H2O + O2

Introduo a cocos Gram-positivos

+
Micrococcaceae
As bactrias desta famlia so
catalase POSITIVAS

Streptococcaceae
As bactrias desta famlia so
catalase NEGATIVAS

Caractersticas do Gnero
Staphylococcus

Esta estrutura
caracterstica lembra
cachos de uva.

Caractersticas do Gnero
Staphylococcus

As sp mais importantes na clnica


S. lugundensis

S. carnosus

S. epidermidis

S. schleiferi

S. simulans

S. capitis

S. sciuri

S. cohnii

S. warnei

S. lentus

S. xylosus

S. caseolyticus
S. hyicus

S. saprophyticus

S. caprae

S. gallinarium

S. hominis

S. chromogenes

S. kloosii

S. intermedius

S. equorum
S. arlettae

S. delphini

S.saccharolyt.

S. haemolyticus
S. auricularis
S. aureus

Caractersticas do Gnero
Staphylococcus

As mais importantes no laboratrio clnico so:


S. lugundensis

S. carnosus

S. epidermidis

S. schleiferi

S. simulans

S. capitis

S. sciuri

S. cohnii

S. warnei

S. lentus

S. xylosus

S.saccharolyt.

S. caseolyticus

S. saprophyticus

S. hyicus
S. chromogenes

S. gallinarium

S. intermedius

S. equorum

S. auricularis

S. arlettae

S. aureus

S. delphini

S. kloosii

S. caprae
S. hominis
S. haemolyticus

Staphylococcus aureus

De todas as espcies do gnero, o S.


aureus o mais importante. responsvel
pelo segundo maior nmero de infeces
em seres humanos.
O S.aureus est presente no trato
respiratrio superior, especialmente nas
narinas, de aproximadamente 60% da
populao em geral, e assim permanece
sem causar doena em condies normais.

Caractersticas do Gnero
Staphylococcus

O gnero Staphylococcus composto por vrias espcies:


S. lugundensis

S. carnosus

S. epidermidis

S. schleiferi

S. simulans

S. capitis

S. sciuri

S. cohnii

S. warnei

S. lentus

S. xylosus

S. caseolyticus
S. hyicus

S. saprophyticus
S. gallinarium

S. chromogenes

S. kloosii

S. intermedius

S. equorum

S. delphini

S. arlettae

S.saccharolyt.
S. caprae
S. hominis
S. haemolyticus
S. auricularis
S. aureus

Staphylococcus aureus

O nome aureus significa


dourado em latim, qualidade
atribuda ao pigmento amarelado
caracterstico produzido pela
bactria.

Enzimas Extracelulares

A enzima extracelular mais importante a coagulase. A produo de


coagulase exclusiva ao Staphylococcus aureus, sendo inclusive, um
critrio para a identificao de uma amostra como pertencente
espcie.
coagulase
Fibrinognio
protrombina

Estafilotrombina
Causa coagulao
Fatores de Virulncia do Staphylos
Staphylos no o nico que produz coagulase

Fibrina

Staphylococcus aureus

No laboratrio clnico, faz-se um ensaio com plasma de coelho. A


bactria em questo inoculada num tubo com plasma de coelho.
Se o plasma coagular, a espcie S. aureus.

Se no coagular deixar mais 20h, totalizando 24h verificar novamente

Staphylococcus aureus

Protena A (SpA)
Tem a habilidade de se ligar poro
FC de IgG, impedindo, portanto que ela
sirva de fator de opsonizao na
fagocitose. Fab
Fab
IgG
S. aureus

Fc

SpA (Atn)

Testes de aglutinao rpida


para coagulase

Testa a presena de proteina A e fator de coagulao


(clamping factor)
Fornece resultado + em 5 a 20 seg.
Mostra correlao de 80% com mt.classico
preo e mbalagem com 150un. U$116.00

Teste de aglutinao do latex azul para deteco do clumping


factor e protein A associado Staphylococcus aureus
Resultado em 60 seg
Sensibilidade/especificidade: 99/92%
Inclui partcula de latex , carto p/teste, haste, e controles
positivo e negativo
Preo: embalagem de 105 um. U$ 105.62
Validade 18 meses

Padres de Hemlise

esverdeado

Regulao de Fatores
de Virulncia

Os fatores de virulncia produzidos por S. aureus no so


expressados a toda hora, so dependentes da fase de crescimento
da bactria.
no de clulas

Protena A
adesinas
coagulase
hemolisinas
Toxinas
Alimento em abundncia

alimento
Taxa estacionria

Protena A
adesinas
coagulase
hemolisinas
toxinas

tempo

Staphylococcus epidermidis

A segunda espcie mais importante


do gnero Staphylococcus o
Staphylococcus epidermidis.
O Staphylococcus epidermidis faz
parte da flora normal da pele e da
mucosa de seres humanos e
animais superiores.

Importante na infeco hospitalar

Staphylococcus epidermidis

O Staphylococcus epidermidis uma espcie bem menos


virulenta do que S. aureus. No apresentam a produo de
coagulase e algumas cepas apresentam a produo muito
tmida de certas enzimas proteolticas.
Todavia, isto no significa que S. epidermidis no possa ser
patognico. Esta espcie tem muitos fatores de adeso e
forma muito biofilme, sendo perigosa para pacientes que
fazem uso de material invasivo de plstico (cateter, prteses,
stents, etc.).

Staphylococcus epidermidis

O Staphylococcus epidermidis um risco para pacientes


imunocomprometidos e para usurios de drogas
intravenosas, podendo causar endocardite e infeces
generalizadas no-piognicas.
Staphylococcus epidermidis pode causar septicemia,
endocardite, peritonite, ventriculite e infeces em locais
com prtese.

Outras espcies de
Staphylococcus

No laboratrio clnico, usualmente se faz a diferenciao


entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e
Staphylococcus coagulase negativa (no aureus).
Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse so
subdivididos em dois grupos: saprophyticus e no
saprophyticus, baseado na sua suscetibilidade
novobiocina.

Outras espcies de
Staphylococcus

No laboratrio clnico, usualmente se faz a diferenciao entre


Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e
Staphylococcus coagulase negativa (no aureus).
Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse so
subdivididos em dois grupos: saprophyticus e no
saprophyticus, baseado na sua suscetibilidade novobiocina.

Identificao simplificada dos cocos Gram


positivo de importncia clnica

Gnero

Catal.

Motilidade NaCl 5%

Oxidase

Aerbio

Ttrade

Estrito
Staphylococcus

neg

neg

no

no

Planococcus

neg

varivel

Micrococcus

neg

varivel

varivel

Enterococcus

neg

varivel

neg

no

no

Streptococcus

neg

neg

varivel

neg

no

no

Aerococcus

neg

neg

neg

no

Stomatococcus *

varivel

neg

neg

neg

no

varivel

* aderente ao meio

Chave Geral para a


Identificao de Staphylococcus

Coco GRAM +
Streptococcaceae

Sensvel
novobiocina?

catalase
+
Micrococcaceae
DNAse
+
Staphylococcus sp.

+
Staphylococcus
no saprophyticus

Coagulase
-

Staphylococcus grupo saprophyticus

Staphylococcus
aureus

Outras espcies de
Staphylococcus

No laboratrio clnico, usualmente se faz a diferenciao


entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus)
e Staphylococcus coagulase negativa (no aureus).

Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse


so subdivididos em dois grupos: saprophyticus e no
saprophyticus, baseado na sua sensibilidade
novobiocina.

Chave Geral para a


Identificao de Staphylococcus

Espcies de Staphylococcus
do grupono saprophyticus
(Grupo epidermidis)
S. epidermidis
S. haemolyticus
S. hominis
S. capitis
S. warneri

Espcies de Staphylococcus
do grupo saprophyticus

S. saprophyticus
S. cohnii
S. xylosus

Staphylococcus saprophyticus

O Staphylococcus saprophyticus de interesse clnico pois


frequentemente causa infeco do trato urinrio, especialmente
em mulheres, podendo chegar a causar cistite, uretrite e
pielonefrite, e em casos extremos bacteremia.

As outras espcies de Staphylococcus de interesse clnico


causam infeces parecidas com o S. epidermidis, e o
tratamento igual. Logo, o mais importante discriminar o
Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) do
Staphylococcus coagulase negativa.

Deteco de resistncia
de Staphylococcus aureus
oxacilina e ou vancomicina

Resistncia aos Antibiticos

A primeira vez que um


antibitico foi usado,
clinicamente, foi contra uma
infeco por Staphylococcus
aureus.

Sir Alexander Fleming

Resistncia aos Antibiticos

A penicilina funcionou bem contra


infeces estafiloccicas at os
anos 60, quando rapidamente
comearam a surgir cepas
resistentes penicilina.

Resistncia aos Antibiticos

Para contornar o problema, foi criado


o beta-lactmico sinttico meticilina,
que era resistente ao das betalactamases.

Anel b-lactmico

meticilina

Resistncia aos Antibiticos

A meticilina funcionou bem at os anos


70, quando comearam a surgir as
cepas resistentes a meticilina (MRSA).

meticilina

Resistncia aos Antibiticos

Todo antibiticos beta-lactmico se liga a enzimas que participam da sntese da


parede celular chamadas PBPs (Protenas Ligadoras de Penicilina). O MRSA
desenvolveu uma outra PBP, chamada PBP2' ou PBP2a. Esta PBP
plenamente funcional mas no tem afinidade por beta-lactmicos.

penicilina

PBP2a
(PVN) ligadora de penicilina = enzima

Resistncia aos Antibiticos

Devido a este mecanismo de resistncia, as cepas MRSA/ORSA so


resistentes no s penicilina, mas a todos os antibiticos betalactmicos!
No laboratrio clnico, deve-se reportar num antibiograma resistncia a
todos os beta lactmicos (inclusive cefalosporinas e carbapenemas s
vezes so suscetveis = ocorre apenas in vitro) quando a amostra for
MRSA mesmo quando so sensveis a alguns beta lactmicos in
vitro.
A PBP2a codificada pelo gene mecA. Este gene carreado num
elemento gentico mvel chamado de Cassete Cromossmico
Estafiloccico mec (SCCmec).

Staphylococcus aureus
resistente oxacilina-ORSA

CIM meticilina
Nivel de
expresso

mecA

PBP2a

bla

Maioria

Subp-R

Freq de
Subp-R

BorderlineBORSA

Baixo

+++

MOD-SA

Baxo

PBP 1,3,4

Heterognea

Baixo

1,5-3

200

107

Heterognea

Medio

6-12

400

10-5

Heterognea

Alto

10-200

800

103

Homognea

Alto

+/-

800

800

Modalidade

b la: b -lactamase; CIM em m g/ml; Subp-R: subpopulao resistente.

Mtodos laboratoriais
para a deteco da resistncia
oxaclina ( meticilina)

Para detectar a resistncia a oxacilina no laboratrio clnico, pode-se utilizar a


tcnica de disco difuso em gar (Kirby-Bauer).
Tambm pode-se detectar cepas MRSA atravs de um gar screening de
oxacilina que gar Mller-Hinton com NaCl a 4% e uma concentrao de
oxacilina de 6g/mL de oxacilina. O crescimento de uma ou mais colnias
indica resistncia a oxacilina.
Para a determinao da concentrao inibitria mnima de oxacilina, o mtodo
de macrodiluio em caldo deve ser feito com caldo Mller-Hinton com uma
concentrao final de 4% de NaCl.

Mtodos laboratoriais
para a deteco da resistncia
oxacilina ( meticilina)

O estudo das CIM mediante prova de E-test com fita de oxacilina uma
alternativa vlida em casos de dvida, com uma eficcia diagnstica
praticamente similar ao do mtodo de referncia de diluo em gar hiper
salino, a concentrao crtica de 6 g/ml de oxacilina (NCCLS,1997).
Sistemas automatizados de micro diluio nem sempre oferecem
sensibilidade, especificidade e eficcia suficientes para a deteco deste
tipo de cepas, quando comparado aos mtodos de referncia (Snchez,
1998),
Um mtodo alternativo, rpido e eficaz, embora nem sempre aplicvel
em rotina, a deteco do gene mecA, por mtodos de amplificao por
PCR (Murakami et al., 1991). Este mtodo teria a vantagem de no estar
sujeito s condies do crescimento da cepa, podendo ser aplicado em
grande nmero de isolados, empregado em casos de dvida com valores
de CIM prximo do limite.

Resistncia Vancomicina

O mecanismo de resistncia vancomicina em Staphylococcus aureus


ainda no foi elucidado, e parece ser bem mais complexo do que ocorre
em Enterococcus, envolvendo uma multiplicidade de genes.
Em S. aureus, ocorrem fenmenos bizarros e pouco ortodoxos em
relao resistncia vancomicina. Primeiramente, a morfologia das
colnias de VRSA heterognea, dando a impresso de contaminao.

VSSA

VRSA

VRSA

VSSA

VRSA

VRSA

Resistncia aos Antibiticos

Em 1997, foi relatada no Japo, a primeira


cepa clnica de Staphylococcus aureus
resistente vancomicina (VRSA), pelo
Prof. Keiichi Hiramatsu, da Univesidade
Juntendo em Tquio.

Resistncia aos Antibiticos

Em 2000, foram encontradas as primeiras 5 cepas de Staphylococcus aureus


resistentes vancomicina (VISA) no Brasil, num Hospital de referncia de
queimados.
Infection Control & Hospital Epidemiology. 22(7):443-448, July 2001.
ISOLATION IN BRAZIL OF NOSOCOMIAL STAPHYLOCOCCUS AUREUS
WITH REDUCED SUSCEPTIBILITY TO VANCOMYCIN
Oliveira Geraldo A. MD; Dell'Aquila, Adriana M. MD; Masiero, Rita L. Pharm;
Levy, Carlos E. PhD; Gomes, Marcia S. Pharm; Cui, Longzhu PhD; Hiramatsu,
Keiichi PhD; Mamizuka, Elsa M. PhD
Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of Sao Paulo (Oliveira, Levy, and
Mamizuka) General Public Hospital, Sao Paulo, Brazil (Dell'Aquila, Masiero, and
Gomes) Department of Bacteriology, Juntendo University, Tokyo, Japan. (Cui,
and Hiramatsu)

Resistncia Vancomicina

Outro fenmeno comum oxacilina e a vancomincina a ocorrncia


da resistncia heterognea (hetero-resistncia) de S. aureus a estes
antibiticos. Ocorre que certas cepas apresentam um MIC baixo de
vancomicina (<4g/mL), ou a oxacilina (<2g/mL), sendo
consideradas sensveis por mtodos tradicionais de avaliao
sensibilidade. Todavia, no caso da vancomicina por ex. estas cepas
podem conter subpopulaes de clulas que apresentam um MIC
8g/mL, numa freqncia de 1:106 clulas. Estas clulas no so
detectadas por mtodos tradicionais (antibiograma e MIC).
A nica forma de se detectar uma cepa hetero-VRSA atravs de uma
anlise de populaes, onde se inocula diferentes diluies de uma
suspenso bacteriana em meio de cultura silido adicionado de
concentraes crescentes de vancomicina.

Resistncia Vancomicina

Quando o resultado plotado num grfico obtm-se trs


possibilidades distintas de curva:

VRSA
heteroVRSA

VSSA
Sensvel Vancomicina

Resistncia Vancomicina

Observou-se tambm, por morfometria, que enquanto as cepas sensveis


vancomicina apresentavam um espessamento da parede celular normal, VRSA
apresentavam uma espessura bem maior, e a hetero-VRSA ficando entre a VRSA e
VSSA

Resistncia Vancomicina

Parece portanto, que a resistncia vancomicina est ligada a uma


exacerbao da sntese da parede celular, em que inmeros genes
regulatrios estariam envolvidos.
At agora, todavia, ningum parece saber por certo quais genes
esto envolvidos e at que ponto. Uma das grandes limitaes no
estudo do mecanismo de resistncia vancomicina em S. aureus
que a emergncia da resistncia um fenmeno ainda raro. Existem
ainda poucas cepas no Mundo atualmente

Deteco da VISA/VRSA

Deteco da VISA/VRSA

Pelo laboratrio
de referncia

Resistncia a Macroldeos

Os macroldeos so antibiticos de primeira escolha s para Streptococcus


pneumoniae, dentre os Gram positivos.
Os macroldeos utilizados na clnica so:
Eritromicina
Claritromicina
Azitromicina

nico macroldeo
disponvel por 40
anos!!

O lanamento dos novos macroldeos recentemente aumentou o uso


destas drogas.

Resistncia a Macroldeos

Os macroldeos so
inibidores da sntese
protica bacteriana. Os
ribossomos bacterianos
tm duas subunidades:
30S e 50S.

Resistncia a Macroldeos

aa

Os macroldeos tm
afinidade pela
subunidade 50S do
mRNA ribossoma bacteriano.
tRNA

ribossoma

Os macroldeos interferem na sntese de protenas por bloquear o


stio ativo do ribossoma por impedimento estrico.

Resistncia a Macroldeos

A resistncia aos macroldeos ocorreu pela primeira vez, em 1953. A bactria


metilava o rRNA que perdia afinidade aos macroldeos. A metilao feita
por uma adenina N6-metiltransferase, cujo gene denominado erm
[Erythomycin Ribosome Methilation].
Os genes erm geralmente esto localizados em elementos genticos
mveis, tal como transposons, geralmente inseridos no cromossoma. Alguns
destes transposons residem em plasmdios.
Os genes erm muitas vezes esto associados presena de genes que
conferem resistncia tetraciclina (genes tet).

Resistncia a Macroldeos

As lincosamidas (clindamicina)
e as estreptograminas tm o mesmo alvo (50S
rRNA) que modificado pelos genes erm.

Estes antibiticos so denominados como pertencentes ao grupo MLS

Resistncia a Macroldeos

Os genes erm conferem resistncia tanto eritromicina quanto


clindamicina. Mas a resistncia clindamicina s detectada in vitro com
a induo por eritromicina.
Eritromicina
(bom indutor)

Clindamicina
(mal indutor)

erm-

Achatamento
do Halo

erm+

Relao de drogas testadas para


Staphylococcus aureus e relatadas no
antibiograma

Para Staphylococcus aureus e coagulase negativos oxacilina resistentes, no


testar cefalosporinas, penicilinas de amplo espectro ou Imipenem, pois falso
resultados sensveis podem ocorrer.

S. saprophyticus mantem boa sensibilidade e no precisam ser testados


pois dificilmente apresentam resistncia SMXTMP, quinolonas e
nitrofurantona, (drogas de escolha).

Staphylococcus aureus ou coagulase negativos sensveis penicilina so


sensveis a todos os beta-lactmicos. Testar pelo disco de penicilina e no
de ampicilina. Se produtoras de beta-lactamase pelo testes acidimtrico,
iodomtrico ou da cefalosporina cromognica(nitrocefin) considerar resistente
a ampicilina e penicilina.

Staphylococcus resistente a penicilina produtor de penicilinase e


resistente a todas as penicilinas: ampicilina, amoxicilina, piperacilina e
ticarcilina. A associao de penicilinas com inibidores: sulbactam, clavulanato
e tazobactam s tero atividade para os estafilococos oxacilina-sensveis.

Relao de drogas testadas para


Staphylococcus aureus e relatadas no
antibiograma

Staphylococcus aureus e outros coagulase negativos quando resistentes


oxacilina considerar como resistentes a :Penicilinas (penicilina, ampicilina
com e sem inibidor de beta-lactamase[sulbactam], amoxicilina com e sem
inibidor [clavulanato], piperacilina com e sem inibidor, Ticarcilina com e sem
inibidor), cefalosporinas de 1a, 2a, 3a, 4 , Aztreonam( droga sem atividade
contra Gram positivos), e Carbapenens(Imipenem, Meropenem e
ertapenem)

Staphylococcus spp com teste para gene mecA+= oxacilina R (existem


testes de
aglutinao especficos para detectar este gene.

Staphylococcus spp podem desenvolver resistncia durante a terapia com


quinolonas, por isso amostras diferentes devem ser sempre testadas e no
repetir o antibiograma anterior.

Todo Staphylococcus aureus com halo para vancomicina 14mm deve-se


testar a CIM e aqueles com CIM4g enviar a Laboratrio de referncia.

Prevalncia de resistncia

Prevalncia de resistncia