UNIVERSIDAD TECNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERIA EN ALIMENTOS

CARRERA DE INGENIERIA BIOQUIMICA
INGENIERIA GENETICA
MUTACIONES DE LA REGIN PRECORE,
PROMOTOR BASAL DEL CORE Y POLIMERASA
VIRAL EN PACIENTES CON HEPATITIS B
CRNICA
ARTCULO CIENTFICO:
HOSPITAL VIRGEN DE LA
VICTORIA
UNIVERSIDAD DE MALAGA
MALAGA- ESPAA

22 DE NOVIEMBRE DEL 2011

AINHOA GUTIRREZ, ISABEL VICIANA,

FRANCISCA RIUS Y ALFONSO PINEDO

OBJETIVOS DE LA
INVESTIGACIN

Realizar una cohorte de seguimiento en los

pacientes con mutaciones core/precore en
el Hospital Virgen de la Victoria de la
ciudad de Mlaga.
Relacionar los resultados en funcin a la
incidencia de la Hepatitis B Crnica en
Espaa.
Determinar el Frmaco adecuado para
combatir el VHB.

ABREVIATURAS Y
TERMINOLOGA

VHB: Virus
Hepatitis B.

de

la

AgHBe: Antgeno E del

VHB.

AgHBs:
Antgeno
superficie del VHB.

de

AgHBc: Antgeno del core

del VHB.
EHC:
Enfermedad
heptica crnica

ORF: Marco abierto de

lectura.

UI:
Unidades
Internacionales.

SHBs:
Protena
pequea del AgHBs.
HNF: Factor heptico
nuclear.
RVS: Respuesta viral
sostenida.
TNF: Factor de necrosis
tumoral.
IFN: Interfern.
LMV: Lamivudina.
ADF: Adefovir.

INTRODUCCIN

La infeccin por el virus de la hepatitis B

(VHB) es una de las causas ms
frecuentes de enfermedad heptica
crnica en el mundo afectando a 400
millones de personas.
En Espaa la prevalencia es del 0,7 %,
siendo la tercera causa de Enfermedad
Heptica Crnica, por detrs de la
hepatitis C y el alcohol.

0,7% DE INCIDENCIA.
GENOTIPOS A Y D.

VIRUS DE LA HEPATITIS B
CLASIFICACION DEL VIRUS

GRUPO:
VII
(Virus
ADN
bicatenario retrotranscrito).
FAMILIA: Hepadnaviridae.
GNERO: Orthohepadnavirus
ESPECIE: Virus de la Hepatitis B.

CARACTERISTICAS GENERALES
REPLICACIN: Transcripcin
inversa del ARN pregenmico a
ADN genmico, (Pararetrovirus).
El
VHB
es
extraordinariamente estable
a
solventes
orgnicos.
Tambin es resistente a
temperatura y a pH.
El VHB es la causa ms

Envuelt
a
NUCLEOCAP
SIDE

ADN
VHB
(3,2Kb)

GENOMA DEL VHB

CADENA NEGATIVA (-): 3,2 Kb de
longitud.

PM: 1,6*10+4 D.

Acta como molde en la sntesis de

los ARNm vricos.

Los extremos 5 y 3 tienen una

repeticin de 9 nucletidos, por lo
que existe una pequea regin
donde el genoma es tricatenario

CADENA POSITIVA (+): Posee una

longitud menor de 3,2 Kb.

Regin Monocatenaria: oscila entre

20%-80% de la longitud de la cadena
(-).

La estructura circular abierta del

genoma se mantiene gracias a que en
los extremos 5 de ambas cadenas existe
una zona cohesiva de 224 nucletidos.
Se
localizan
dos
secuencias
directamente repetidas de 11 pb,
llamadas DR1 y DR2 que juegan un
papel primordial en la replicacin del

ORGANIZACION GENOMICA DEL VBH

4 PROMOTORES (Sntesis ARNm

del VHB)
Promotor SPI

1.
.

Activo
HNF).

para

Hepatocitos

(Activador:

Caja TATA: ARNm de 2.4Kb- LHBs.

2.

Promotor SPII:

Transcripcin en 5 mas sitios.

Transcrito mas largo para MHBs/SHBs.

2
1

Promotor CP:

3.
.

Activo
para
clulas
hepticas
(Activadores: HNF-Ill y C/EBP).

Transcripcin en 2 sitios separados por

4 nt: ARNm de 3.5Kb.

Transcrito mas largo para Hbe/HBc.

4.

Kb.

Promotor XP: sntesis del ARN de 0.8

ORGANIZACION GENOMICA DEL VBH

2
ACTIVADORES
ENHANCERS

(Sntesis ARNm Viricos).

1.
.

2.

Enhancer I (En I).

Puede activar en uno
rdenes de magnitud
promotores.

o dos
los 4

No es especifico del hgado.

Enhancer II (En II).

Activa los promotores S en

aproximadamente un orden de
magnitud.

Es especifico de Hepatocitos y es
activado
por
factores
de
trasncripcin: C/EBP y HNF-lIl.

1
2

ORGANIZACION GENOMICA DEL VBH

CADENA NEGATIVA (-):

4 ORF (Proteinas del virus).

C: 2 codones de iniciacin que dividen la

ORF en las regiones pre-core y core, codifica
para las protenas de la nucleocpside.
1.

Regin Core: AgHBc.

Regin Pre-core: AgHBe.

2.

P: Codifica para la ADN polimerasa.

3
2

ACTIVIDAD:
.

Transcriptasa Inversa.

ARNasa H.

S: Codifica para el antgeno de superficie

(HBsAg). Exiten 3 codones de iniciacin:
3.

pre-S1: LHBs.

pre-S2: MHBs.

S: SHBs.

X: Codifica una protena reguladora HBx

con capacidad transactivadora de la
expresin gentica viral y celular.
4.

ORGANIZACION GENOMICA DEL VBH

1.

GRE (Elemento que responde frente a

la Glucocorticoides).

In vitro activa a los 4 promotores

alrededor de 5 veces.

In vivo se desconoce la funcionalidad.

2.
.

Hexanucleotido conservado en todos

los Hepadnavirus.

Se encuentra en la regin del genoma

del VBH que codifica para el AgHBc.

Esta seal es activa cuando se

encuentra a ms de 400 bases del
promotor.

3.

TATAAA (Seal de Terminacin).

(Seal de Encapsidacin).

Secuencia de 61 nt. propia de los

Hepadnavirus.

Dirige la encapcidacin de las

protenas del core y la polimerasa viral
para formar la nucleocpside.

MUTANTES DEL VHB EN LA

REGION PRECORE
Carman et al. (1989) estudiaron el suero de pacientes y descubrieron que estaban infectados por una
variante del VBH presentando una mutacin en la regin pre-core.
Esta mutacin consiste en una transicin de G a A en la posicin 1896. Esta mutacin da lugar al
cambio del codn 28 TGG que codifica para el aminocido triptfano por un codn de terminacin TAG,
que impide la sntesis del AgHBe.
Posteriormente, el aislamiento de este mismo mutante por parte de otros grupos de investigadores de
otros pases demostr que esta variante est ampliamente distribuida en todo el mundo.

MATERIALES Y MTODOS

Estudio
de
cohorte
de
seguimiento
prospectiva
durante
5
durante
5 aos
aos a
a 168
168
pacientes con el virus de la
hepatitis B.

La extraccin se llev a cabo

con el sistema automatizado
MagnaPure
(Roche).
La
recogida y almacenamiento
de muestras se hicieron
siguiendo las normas del
comit
de
tica
e
comit
de
tica
e
investigacin del hospital.

Los datos recogidos de los

pacientes y los obtenidos de
las
diferentes
tcnicas
realizadas
se
incorporaron
realizadas se incorporaron a
a
una base de datos utilizando
el paquete informtico SPSS
para Windows versin 15.0.

Las determinaciones de los

marcadores
marcadores serolgicos
serolgicos se
se
realizaron mediante EIA

La deteccin de mutaciones
core y precore con el kit de
secuenciacin abierta
de
Siemens tras doble PCR de
dicha
regin
utilizando
primers especficos del VHB
segn
segn la
la tcnica
tcnica descrita
descrita por
por
Poovorawan et al.

Para
las
variables
de
Para
las
variables
de
naturaleza
cualitativa
se
calcularon las tablas con las
respectivas distribuciones de
frecuencia
frecuencia y
y para
para las
las de
de
naturaleza cuantitativa, los
estadsticos descriptivos de
centralizacin
centralizacin y
y dispersin
dispersin
ms usuales.

Los niveles de ADN del VHB

se determinaron en suero
utilizando
el
sistema
VERSANT HBV DNA 3.0
(bDNA)
(bDNA) de
de Siemens
Siemens (factor
(factor
de conversin aportado por
el fabricante [1 UI/mL = 5,6
copias/mL]).

El genotipado del VHB y las

mutaciones
mutaciones de
de resistencia
resistencia
antiviral se determinaron en
suero por secuenciacin de
cidos nucleicos con el kit
Trugene
HBV
Genotyping
Trugene
HBV
Genotyping
(Siemens)
que
detecta
genotipos
de
la
A-G
amplificando
una
secuencia
amplificando una secuencia
definida de la polimerasa del
virus.

En todos los casos se

consideraron
resultados
significativos
significativos cuando
cuando el
el nivel
nivel
de significacin obtenido fue
inferior al 5 % (p < 0,05).

RESULTADOS

Una de las regiones del genoma del virus de la hepatitis

B ms analizadas y que presentan mayor frecuencia de
mutaciones, es la regin PRECORE/CORE y el promotor
correspondiente
(SPI: Caja TATA).
La doble mutacin A1762T/G1764A del promotor es la de
mayor impacto sobre la replicacin del virus de la
hepatitis B y la RESPUESTA A LA TERAPIA ANTIVIRAL.
Los FRMACOS analizados para este estudio fueron:
INTERFERN ALFA.
LAMIVUDINA.
ADEFOVIR.
ENTECAVIR.
TENOFOVIR.

RESULTADOS
Inicialmente
el
estudio
realizado en el Hospital
Virgen de la Victoria, inici
con 168 pacientes, de los
cuales 114 eran hombres y
54
eran
mujeres
comprendiendo una edad
entre
17-83
aos
presentando algn posible
indicio de hepatitis B como
enfermedad principal para
este estudio.
Sin embargo de los 168
pacientes,
11
no
presentaron
ninguna
mutacin y en 31 pacientes
no se logr amplificar la
muestra.
Por esta razn el estudio se
realiz con 126 pacientes
que si presentaron algn
tipo de mutacin asociada.

PCR DE LA REGIN PRE-CORE DEL VHB

Gel de Agarosa al 2% teido con bromuro de etidio en

el que se observa la banda de 198pb correspondiente
al fragmento de PCR de la region pre-core del VHB,
procedente de muestras de suero de los pacientes.

RESULTADOS EN FUNCIN A LOS

FARMACOS EMPLEADOS
INTERFERON ALFA

El interfern alfa se utiliza para tratar la

hepatitis B crnica pero su uso se
encuentra limitado, ya que la tasa de
respuesta es inferior al 50 % y las
recadas son frecuentes.

Generalmente si no existe ninguna

mejora a los 3-4 meses de tratamiento,
debe suspenderse el interfern alfa.

LAMIVUDINA

Pertenece
a
una
clase
de
medicamentos
llamados
inhibidores nucleosdicos de la
transcriptasa inversa.

Acta disminuyendo la cantidad

de VIH y hepatitis B en la sangre.

ENTECAVIR

ADEFOVIR

El adefovir pertenece a una clase de

medicamentos llamados anlogos
nucletidos. Funciona al reducir la
cantidad de VHB en el cuerpo.
El adefovir no cura la hepatitis B y no
puede prevenir las complicaciones de
la hepatitis B crnica como la cirrosis
del hgado o el cncer heptico.
Cuando deja de tomar adefovir la

Se usa para tratar la hepatitis B

crnica de largo plazo en las personas
que presentan daos en el hgado.

TENOFOVIR

Es un medicamento antiviral que previene

que
las
clulas
del
virus
de
inmunodeficiencia humana (VIH) o del virus
de hepatitis B se multipliquen en el cuerpo.

TABLA 2. RESPUESTA AL TRATAMIENTO ENTRE LOS PACIENTES

CON MUTACIONES CORE Y PRECORE DE VHB

RESULTADOS
De esta nueva muestra (126), 81 pacientes con mutaciones
Core y Precore recibieron tratamiento antiviral, y de ellos, 35
pacientes mantuvieron respuesta viral sostenida (RVS) 12
meses tras finalizar el tratamiento.

RESULTADOS
TABLA 3. DISTRIBUCION DEL GENOTIPO EN LOS 126
PACIENTES CON MUTACIONES CORE Y PRECORE MAS
PREVALENTES DE LOS PACIENTES CON HEPATITIS B
CRNICA.

DISCUSIN

CONCLUSIONES

Se realiz una cohorte de seguimiento en los pacientes con

mutaciones core/precore en el Hospital Virgen de la Victoria
de la ciudad de Mlaga, obtenindose a travs de esta
investigacin una relacin entre las 3 principales mutaciones
asociadas al Virus de la Hepatitis B predominantes en
Espaa,
siendo
estas:
G1896A,
A1762T/G1764A
y
A1762T/G1764A, G1896A.
En este estudio, se demuestra una vez mas que Espaa
presenta los genotipos de VHB A y D, predominando
principalmente el genotipo D en una relacin 7:5.
Adems se determin que el TENOFOVIR es el mejor frmaco
de eleccin para el tratamiento inicial de la Hepatitis B como
en el rescate incluso de los pacientes con mutaciones de
resistencia a otros frmacos.

BIBLIOGRAFIA

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