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Tcnicas de Eletroforese

Rodrigo Rocha Latado

Eletroforese
Diversos mtodos para anlise de:
cidos nuclicos (DNA e RNA)
Protenas
Enzimas

ETAPAS
Preparar a amostra (DNA total, Produtos de PCR,
Protenas, etc...)

Preparar o gel
Aplicar as amostras no gel
Eletroforese
Colorao do gel, Fixao, Documentao

CLASSIFICAO
Tipos:
- agarose
- poliacrilamida

desnaturante
no desnaturante
- amido (para isoenzimas)

Princpios:
- carga eltrica e tamanho da molcula (partcula)
- pH (focalizao isoeltrica)

Deteco:
brometo de etdeo, SYBR, nitrato de prata,
fluorescncia
substratos especficos (isoenzimas)

Visualizao:
UV, direta, cmera

Eletroforese

Sharp, Sambrook and Sugden

Eletroforese

Syber green

Singer VL, Lawlor TE, Yue S. 1999. Comparison of SYBR Green I


nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity
in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay
(Ames test). Mutat. Res. 439(1):37-47.

http://www.probes.com/servlets/product?region=0&item=7563

cidos Nuclicos
cido nuclico exposto a campo eltrico
migra para eletrodo na velocidade ou
mobilidade proporcional a fora do campo e
a carga lquida da molcula
mobilidade: inversamente proporcional ao
coeficiente friccional
coeficiente friccional: funo do tamanho e
forma da molcula e viscosidade do meio

Eletroforese
Molculas separadas por:
tamanho
forma ou conformao
magnitude de cargas

Sob pH fisiolgico -> fosfatos ionizados


polinions correm em direo ao eletrodo
positivo
Eletroforese plo negativo -> plo positivo

Eletroforese

Eletroforese
Tamanho da Molcula de DNA
DNA linear migra inversa/ proporcional ao log10
do seu peso molecular

Eletroforese
AGAROSE:
polissacardeo linear de galactose com
unidades de -D-galactopiranose com ligaes
1,3 e 3,6-anidro-a-L-galactopiranose
PM mdio: 120.000 Da

Agarose

Eletroforese em gel de agarose


- Tampo (TAE ou TBE) e agarose
- Concentrao agarose varia entre 1 e 3%
- Fundir a agarose no tampo e aplicar na frma
- Esperar esfriar, retirar o pente
- Aplicar as amostras no gel
- Iniciar a eletroforese

Eletroforese
Tampes: gua eletrolisada gerando H+
no anodo e OH- no catodo
terminal catdico (+) -> bsica
terminal andico (-) -> cida

requer tampo para evitar gradientes de


pH

Eletroforese
Tampo

Aplicao e comentrios

TAE

Usar quando o DNA vai ser recuperado


Usar para eletroforese de DNA de grande tamanho (> 12 Kb)
Baixa fora inica
Propriedades:
Baixa capacidade tamponante - recirculao pode ser necessria para
corridas eletroforticas longas (> 6 horas).

TBE

Usar para eletroforese de DNA pequeno (< 1 Kb)


Melhor resoluo de DNA pequeno (< 1 Kb)
Mobilidade do DNA mais restrita
Alta fora inica
Propriedades:
Diminui a mobilidade do DNA.
Alta capacidade tamponante - no requer recirculao para corridas
longas.

Eletroforese
TAE

para recuperao de fragmentos


preferido molculas maiores
menor campo de fora
maior porosidade

TBE
preferido para molculas menores < 1Kb
interage com agarose - poros menores

Eletroforese
Voltagem
expressar sempre em V cm-1
gradiente de voltagem - distncia entre eletrodos
voltagem excessiva - rastro de banda
voltagem baixa - difuso de bandas pequenas <1 Kb
TBE - bandas pequenas mais finas
TAE - bandas maiores

Eletroforese
Tamanho

Voltagem

< 1 kb

Tampo
Recuperao

Anlise

5 V/cm

TAE

TBE

1 to 12 kb

4-10 V/cm

TAE

TAE/TBE

> 12 kb

1-2 V/cm

TAE

TAE

Eletroforese
Tempo de corrida
correr gel at banda de interesse ter migrado de
40 a 60% do comprimento do gel
parte inferior do gel - difuso e disperso

Eletroforese
Tampo de Carregamento:
Concentrao 6 a 10x
aumentar densidade da amostra - depositar
amostra no fundo do poo
adicionar cor a amostra
adicionar corantes de mobilidade ou migrao
azul de bromofenol
xileno cianol
verde de bromocresol

EletroforesePoliacrilamida

GEL DE POLIACRILAMIDA
- Gis de Poliacrilamida so obtidos a partir da formao
de ligaes entre o polmero acrilamida e o co-monmero
bis-acrilamida.
- Essa reao covalente geralmente catalizada por
persulfato de amnio e iniciada por TEMED, uma amina
terciria.
- Uma ampla faixa de tamanho de poros pode ser obtida
atravs de variaes de:
Concentrao de acrilamida e bis-acrilamida
Grau de polimerizao

GEL DE POLIACRILAMIDA
- A matriz de poliacrilamida por possuir poros
menores do que a matriz de agarose, gis de
acrilamida so usados para separar fragmentos de
DNA menores que 2 kpb, enquanto que molculas de
at 200 kpb podem ser separaradas em gis de
agarose.
- De forma geral, um gel de 12 cm, a 1% de agarose
separa fragmentos na faixa de 30 a 0,2 Kbp,
enquanto que a 7,5% de poliacrilamida separa entre 1
a 0,05 Kpb.

Eletroforese

O corante Azul de Bromofenol (Bromphenol Blue) migra a


aproximadamente a 300 pares de base e Xileno Cianol (Xylene
Cyanol) a 4 Kpb, independente da concentrao de agarose
entre 0,5 e 1,4% em 0,5 x de TBE.

ACRILAMIDA DESNTAURANTE
- Acrscimo de Uria no gel para a manuteno do DNA na
forma de fita simples
- Amostras de DNA so desnaturadas a 94 -96o C, na
presena de Formamida, antes da eletroforese