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La actividad enzimtica depende del pH

Las E tienen un pH o rango de pH en el cual su


actividad es mxima, por fuera de este la
actividad disminuye.

Rol de los residuos de AA


Los sitios activos de las Enzimas por lo general
contienen grupos ionizables que deben estar en la
forma inica adecuada para mantener la
conformacin del sitio activo (His), unir los
sustratos, o catalizar la reaccin.
Adems el (los) Sustrato (s) pueden contener
grupos ionizables y solo una forma inica del
sustrato puede unirse a la enzima o experimentar
la catlisis.
Conocidos los valores de pK se puede tener alguna
aproximacin sobre los grupos implicados.
Al hacer este estudio, hay que considerar los
posibles efectos del pH sobre la estabilidad de la

V vs. pH, curva A.


El pH ptimo es 6,8.
La curva no informa
por qu la actividad
disminuye a pH
mayor o menor de
6,8, La disminucin
podra ser por
formacin de una
forma inica
incorrecta de E, de S
de ambos de la
inactivacin de E
una combinacin de
todos estos efectos.

pH

pH vs. Estabilidad de la
enzima,
curva B
Preincubacin a pH 5 8
no tiene ningn efecto en
la medida en la actividad
medida a pH 6,8
La disminucin de la
actividad entre pH 6,8 y
pH 8, y entre pH 6,8 y pH
5 debe ser consecuencia
de una forma inica
incorrecta de la E y o de
S.
Cuando la E se preincuba
a pH < 5 >8, la
actividad plena no se
recupera a pH 6,8.

El estudio de la estabilidad con el pH es esencial en


la caracterizacin enzimtica (por lo general siempre
se hace solo la curva A).
La curva de estabilidad puede hacerse preincubando la E al pH indicado durante un tiempo por
lo menos igual al tiempo del ensayo.
La actividad enzimtica se mide entonces en el pH
ptimo.
La estabilidad de una E con el pH depende de
muchos factores:
T
Fuerza inica
Naturaleza qumica del tampn
Concentracin de diferentes preservativos (glicerol,
tioles)
Concentracin de iones metlicos contaminantes

En algunos casos el S puede inducir cambio


conformacional en la enzima hacia una forma
resistente a la desnaturalizacin por pH o
temperatura.
La concentracin misma de la enzima puede ser un
factor, a bajas concentraciones pueden disociarse
en sus monmeros o a oligmeros ms pequeos,
que pueden ser menos estables que el oligmero
original.
Considerar que la E puede ser ms estable durante
un largo perodo de tiempo a un pH
significativamente diferente del ptimo usado para
el ensayo.

Efecto de la temperatura sobre la estabilidad y


actividad de las enzimas.
En muchas reacciones qumicas se ve una mayor v
con el incremento de T. Debido a la mayor
energa cintica a las molculas reactantes, dando
ms colisiones efectivas por unidad de tiempo.
Las reacciones enzimticas se comportan en forma
anloga hasta cierto punto, son protenas ..
Estructura 3D desnaturalizacin.
Al aumentar la T el aumento esperado de v debido
al aumento de colisiones puede ser anulado por la
velocidad de desnaturalizacin.

Una representacin de v vs. T muestra un pico


que se le suele denominar temperatura ptima,
que depende del tiempo de ensayo escogido,
La verdadera T ptima para un ensayo es la
temperatura mxima en la cual la enzima
presenta una actividad constante a lo largo de
un perodo de tiempo por lo menos tan largo
como el tiempo de ensayo.
Esta puede establecerse fcilmente mediante
la preincubacin de la E a diferentes
temperaturas durante una dos veces el
tiempo de ensayo deseado y midiendo la
actividad a una T lo suficientemente baja para
no desnaturalizar E.

La estabilidad de E con la T depende:


pH, fuerza Inica del medio, presencia o
ausencia de ligandos.
Los sustratos a menudo impiden la
desnaturalizacin por T
Las enzimas de bajo MW, compuestos de
cadenas polipeptdicas sencillas con S-S son ms
estables al calor que las de MW alto, enzimas
oligomricas.
En general una enzima ser ms estable al calor
en preparaciones crudas libres de clulas que
contengan una elevada concentracin de otras
protenas ( con tal que no existan proteasas).

, no hay una regla general que determine la


presencia de un tipo de regulacin en los
diferentes sistemas. Para un grado, la
regulacin alostrica puede permitir un fino
control de una va metablica que se requiere
continuamente pero a diferentes nieles de
actividad conforme cambian las condiciones
celulares . La regulacin por modificacin
covalente puede ser total o usualmente
ninguna, el caso con clivaje proteoltico puede
permitir cambios sutiles en la actividad, varios
tipos de regulacin pueden ocurrir en una
simple enzima regulatoria.

Regulacin Enzimtica
El crecimiento y supervivencia de las clulas
depende del uso eficiente de sus recursos, y
esta eficiencia es posible por las enzimas
regulatorias
Enzimas regulatorias
Tienen un efecto sobre la sobre la velocidad
de la secuencia total de una va metablica.
Incrementan o disminuyen la velocidad en
respuesta a ciertas seales, permitiendo a las
clulas hacer los cambios necesarios en
energa y biomolculas requeridas en el

Control a nivel de sustrato


Interaccin del Sustrato o producto con su propia
enzima, Es una consecuencia de la ley de accin de
masas.
A > [S], > V hasta alcanzar Vmax
A > [P], P puede unirse a E inhibiendo la
conversin de S en P
Ejm. Glucosa + ATP
+ ADP

Hexokinasa

Glucosa-6-P

Glucosa-6-P puede actuar tanto como Inhibidor


competitivo como inhibidor no competitivo.
El control a nivel de sustrato no es suficiente para

FEEDBACK retroalimentacin
Una va metablica puede ensamblarse como una
linea:
E1
A
F

E2
B

E3
C

E4
D

A y F pueden ser usados en otros procesos, F pude


usarse
lentamente pudiendo acumularse, A tambin
puede
consumirse pero esto no ejerce un buen control.
La clula puede controlar eficientemente la

E1
E4

E2

E3

A
B
C
D
F
(control feedback
negativo)
As se prev la utilizacin
no deseada de A y la
acumulacin
de F y por consiguiente
el aumento de
concentraciones de
los intermediarios por
reacciones reversibles de
F aumentada

H
B

M
N
Para controlar G y N:
H pude inhibir la enzima de C D, y/o activar
la de enzima C K, N pude inhibir la enzima
C K, y/o activar la enzima C D, H y N
pueden inhibir mutuamente la enzima A B
Ejemplo: vas de sntesis de purinas y
pirimidinas.
La inhibicin y la activacin de Enzimas es
esencial para la regulacin del

Tanto la inhibicin como la activacin de las


enzimas son esenciales para regular el
metabolismo. El control de las vas por lo P finales
hace que las inhibiciones y activaciones
necesarias deban producirse mediante molculas
que procedan de lugares alejados de la va,
diferentes a los S y P de la enzima a regular.

Las vas de las enzimas regulatorias:


Enzimas alostericas funcionan a travs de la
unin reversible no covalente de compuestos
llamados efectores alostericos o moduladores
alostericos.
Modificacin covalente En ambos casos son
protenas multi-subunidades en muchas E el sitio
regulatorio y el sitio activo estn en subunidades
diferentes.
Algunas enzimas son estimuladas o inhibidas
cuando se unen a travs de protenas
regulatorias.

REGULACION ALOSTERICA
A travs de la evolucin los organismos han
desarrollado unas enzimas capaces de realizar
Regulacin alosterica.
Las enzimas alostericas son protenas con
mltiples subunidades y mltiples sitios
activos.
Presentan cooperatividad en su unin al S
(homoalosterismo).
Y una actividad regulada por otras molculas
efectoras o moduladores (heteroalosterismo),
que inducen cambios conformacionales en la E

Interacciones de las subunidades en una


enzima alosterica y su interaccin con sus
moduladores.
Si la enzima tiene
varios
moduladores por
lo general tiene
diferentes sitio de
unin, especficos
para cada
modulador
Las E alostericas
son mas grandes y
ms complejas
que las E no

Estado
T

Estado R

Aspartato transcarbamilasa ATCasa cataliza el primer paso en la


sntesis de pirimidinas

12 cadenas poli peptdicas, 6 catalticas (2complejos


trimericos) y 6 regulatorios (3 complejos dimericos) Las
subunidades catalticas funcionan cooperativamente. Las
subunidades regulatorias tienen sitios de unin para ATP y
CTP, reguladores positivo y negativo respectivamente, CTP
es uno de los productos finales de la va (feed back). Altas
[ATP] energa la clula, esta creciendo y se requiere la
sntesis de pirimidinas para la transcripcin y replicacin

El comportamiento sigmoidal refleja


interacciones cooperativas entre las subunidades
de la enzima el cambio en la estructura de una
subunidad se traduce en cambios estructurales
en las subunidades adyacentes, un efecto
mediado por interacciones no covalentes en la
interfase entre las subunidades.

Modelo Concertado y Secuencial para la


interconversin de los estados R y T durante la
unin cooperativa del ligando (L)
T

Keq

Monod

Koshland

La unin del Ligando (L) a


es ms
dificultosa por que tiene poca afinidad y es ms
estable en ausencia de L pero la unin produce
el cambio conformacional en las otras
subunidades a la forma de mayor afinidad,
facilitando asi el ingreso de otros L a las otras
subunidades (curva sigmoide), desplaza el
equilibrio a la forma de mayor afinidad

La ATCasa sirve como ejemplo para el


comportamiento homotrpico y heterotrpico.
La unin de Aspartato y Carbamil Fosfato a la E
gradualmente lleva el estado T al R, esto lo
explica mejor la grafica de Vo con incremento de S
sigmoide que la hiprbolica.
Pequeos cambios en la [de un modulador]
pueden asociarse con un gran cambio de
actividad.
Un pequeo incremento en [S] en la parte
empinada de la curva causa un gran incremento
en Vo

La regulacin heterotrpica de la ATCasa se da


a travs de la interaccin con el ATP (+) y el
ADP (-)
M+ cambia la
curva hacia la
hiperbolica con
disminucin de
K0.5 pero no de
Vmax ,
incrementando
la V a una [fija
de S],
La E exibe una
curva
caracteristica
del estado R a

El M- produce una curva de saturacin por sustrato ms sigmoidal


con incremento en K0.5

Otras enzimas alostericas heterotropicas


responden a un activador incrementando Vmax
con pequeo cambio en K0.5

Las enzimas alostericas heterotrpicas muestran


diferente respuesta en sus curvas de actividad de
Sustrato debido a que algunas tienen
moduladores inhibitorios, otras tienen
moduladores activadores y otras tienen ambos
como la ATCasa

Algunas enzimas son reguladas por Modificacin


Covalente Reversible
La actividad de la Enzima es modulada por la
modificacin covalente de uno o ms de sus AA, se
han encontrado ms de 500 tipos.
La unin o remocin de grupos es llevada a cabo
por enzimas diferentes. La modificacin equivale a
introducir un nuevo AA en la estructura de la
enzima, puede alterar la carga del AA , con cambios
en la conformacin. La introduccin de grupos
hidrofbicos pueden asociarla a la membrana
Hay incluso protenas que son usadas como grupos
modificadores especiales Ubiquitina y SUMO

Metilacin en la protena quimiotaxis que acepta


metilos (orienta a la bacteria hacia el alimento o algn
toxico )
Acetilacin 80% en eucariotes
Ubiquitinilacin relacionada a protenas de
degradacin, tambin en regulacin . SUMO se
encuentra unidas a protenas nucleares, en la
transcripcin, estructura de cromatina y reparacin de
DNA.
ADP Ribosilacin, en la enzima dinitrogenasa
reductasa bacterial relacionada a la regulacin en la
fijacin de nitrgeno. La toxina difterica y la del colera
catalizan la ADP ribosilacin e inactivacin de enzimas
y protenas claves

Grupos Fosforilos Afectan la Estructura y la Actividad


Catalitica de las Enzimas
Se introduce un
voluminoso grupo
cargado en una
regin
moderadamente
polar los Oxigenos del
P pueden formar H-H
con otros grupos,
amiada de un helice
o guanidinas de Arg.
Las dos cargas (-) del
P pueden repeler AA
cargados (-) como
Asp o Glu.
Esta modificacion
puede tener grandes
efectos en Estructura
y conformacin ,

(Glucosa)n +Pi
Glucosa-1-P

(Glucosa) n-1 +

Algunas kinasas fosforilan preferentemente AA con


vecinos bsicos.
Otras cuando hay cerca Pro.
La estructura 3D puede determinar el acceso y
reconocimiento de un AA para ser reconocido como
S de la kinasa.
Otro factor es la proximidad del AA blanco a otros
residuos fosforilados.
Algunas protenas tienen regiones de consenso
reconocidas por diferentes kinasas, cada una de las
cuales puede fosforilar la protena y alterar su
actividad enzimtica.
En algunos casos la fosforilacin es jerarquica un
AA e fosforilado solo si un vecino ha sido

La Glucogeno sintetasa es inactivada por


fosforilacin de Ser y su actividad tambien es
modulada por otras cuatro kinasas qu fosforilan
otros cuatro sitios en la enzima.
La enzima no es un
sustrato para la kinasa 3 a
menos que un sitio
determinado haya sido
fosforilado por la casein
kinasa II, algunas
fosforilaciones inhiben
mas que otras y algunas
combinaciones son
acumulativas.
Para ser una efectiva la
9 sitios en 5 regiones que proporciona
regulacin, la fosforilacinuna fina y sincronizada modulacin

Algunas Enzimas y Otras Protenas son Reguladas


por Clivaje Proteoltico de una Enzima Precursora
La enzima
precursora
inactiva o
Zimgeno (pro
protenas o
proenzimas) es
cortada por otra
enzima para
formar la enzima
activa, el clivaje
causa cambios
conformacionales
que exponen el

Esta activacin es irreversible, por lo que las


proteasas son inhibidas por inhibidores de
protenas que se unen fuertemente al sitio
activo: Inhibidor de Tripsina (MW 6 000). Antiproteinasa (MW 53 000) inhibe elastasa
(proteasa de elastina componente de tejido
conectivo ) de neutrofilos (tipo de leucocito). La
insuficiencia de -Antiproteinasa causada por
humo de cigararro se asocia con dao y
emfisema pulmonar.
Otro ejemplo es el colageno del tejido conectivo
que se sintetiza como procolageno

Una cascada de Zimgenos activados


proteolticamente producen la coagulacin de la
sangre
Coagulo ???

Fibrinogeno
soluble
Remocin de y knob se produce a travs
de una cascada regulatoria

La cascada regulatoria es un mecanismo es una


respuesta muy sensitiva y amplificada ante una
seal molecular
Una seal activa a X, X activa a Y, e Y activa a Z
(muy especfica)
X,Y y Z son catalizadores as activan mltiples
copias de las siguientes protenas en la cadena.
(amplificacin cada paso)
Algunos pasos de activacin son proteoliticos
irreversibles, otros modificacin covalente
reversible (fosforilacin)
Estas cascadas se producen en diferenciacin
celular, deteccin de la luz por los bastones

Dos cascadas paralelas e


interconectadas
Activacin de plaquetas, la
herida libera colgeno que
interacciona con las
plaquetas que exponen sus
fosfolpidos anicnicos de
superficie y liberan
troboxanos , las plaquetas
activadas se agregan en el
sitio de la herida formando
un coagulo suelto que se
estabiliza con la red de
fibrina
El Factor Tisular TF de
fibroblastos, musculo liso
del endotelio vascular.
Siempre hay una pequea
cantidad de VIIa en plasma

La via extrinsica da un burst de


trombina, el Complejo TF-VIIa
es degradado por la Protena
Inhibidor del Factor Tisular
Factor TFPI la formacin del
coagulo se mantiene por la via
intrinsica.
La perdida del control de la
coagulacin puede bloquear lo
vasos y causar ataque al
corazon y cerebro.
Para clivar el fibrinogeno forma
complejo con la
trombomodulina que cliva a la
protena C activandola que a
su vez forma un complejo con
la proteina S que cliva e
inactiva los factores Va y VIIIa
suprimiendo la cascada total.
Antitrombina III ATIII forma
complejo con Trombina y el

Algunas enzimas regulatorias usan varios


mecanismos regulatorios
Glucgeno fosforilasa presenta una regulacin
primaria a traves de modificacin covalente tambien
es modificada alostericamente por AMP modulador
(+ ) de fosforilasa b y por Glucosa -6-P y ATP
moduladores( -)
Ademas las enzimas que adicionan y remueven
fosfato son reguladas ellas mismas y as el sistema
total, por los niveles de hormonas que regulan la
glucosa sanguinea

Regulacin de la glucgeno Fosforilasa muscular


Tambin entra en juego
[Ca++]

Fosforilasa
Fosfatasa
Inhibidor de la
Fosfo proten
fosfatasa

Presencia de la Enzima
Expresin genetica
Operon

Gen

mRNA

tRNA
rRNA

1.
ejecutores

Informacin
para
su secuencia

Protena reguladora