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ENSAYOS MICROBIOLOGICOS

EN PERSPECTIVA
Q.F. MIRTHA ROQUE ALCARRAZ
MG EN MICROBIOLOGIA

ENSAYOS BIOLOGICOS
Es definido como un procedimiento

experimental donde la potencia de una


sustancia desconocida es estimada por
comparacion de su efecto en un sistema
biologico con un estandar de potencia
conocida.
Bioensayo: ensayo en el cual el poder o
potencia de una sustancia es medido a
travs de la respuesta de organismos
vivos o sistemas vivientes.

Ensayo Microbiologico
El sistema biologico es un cultivo de

microorganismos.

Ensayo Macrobiologico
El sistema biologico es un
numero de organismos
superiores tales como:
Aves
Mamiferos (ratas ,ratones etc)
Organos aislados de animales

Variabilidad
El que se tenga que utilizar seres vivos
Caracteristicas especiales
Que sin excluir la Bioetica
Variabilidad de los efectos que se

obtienen es mayor que en los ensayos


de la fisica o quimica
Obliga el uso de metodos estadisticos
Los resultados se acompaan de Limites
de confianza.

Tipos de Bioensayos
Directo
Determina la dosis o
concentracion capaz
de producir el efecto
deseado
Dosaje de digitalicos

Indirecto
basado en respuestas
cualitativas
Determina la
respuesta deseada
en grupos de
animales
DL50 dosis letal
Dosis efectiva 50

Ensayo Indirecto
Ensayos microbiologicos:
Inhibicion de crecimiento
cuantitativas.
bacteriano por
Se compara los efectos
sustancias antibioticas
de una sustancia
Promocion de
conocida usado como
crecimiento por
patron o estandar con los
sustancias como
de una muestra.
aminoacidos y vitaminas
Establece una relacion
dosis/respuesta y la
ecuacion de regresion
correspondiente.
Basado en respuestas

ENSAYO DE
POTENCIA
ANTIBITICA

HISTORIA

La Penicilina se descubrio en 1929.


En 1939 empieza la investigacion para la produccion
de penicilina y otras sustancias antibioticas.
Norman Heatley un bioquimico fue asignado para
establecer las condiciones de produccion de
penicilina.
En 1940 Heatley ideo el ensayo de difusion en agar
para penicilina.
Heatley la describi en 1944

El mtodo en placa cilndrica descrito por


Edwar Penley Abraham en 1941 para la prueba
de penicilinas fue el primero.
Ms tarde lo modificaron Foster y Woodruft asi
como Schmidt y Moyer.
A partir de 1971 la USP estandariz el mtodo

POTENCIA ANTIBIOTICA
La ACTIVIDAD (POTENCIA) de un

antibitico es estimada comparando


la inhibicin de crecimiento de microorganismos sensibles producida por
concentraciones conocidas del
antibitico que esta examinndose y
una sustancia de referencia.
( ESTANDAR DE REFERENCIA)

JUSTIFICACION
Bajo las condiciones adecuadas, la actividad

POTENCIA de los antibioticos puede


demostrarse por su efecto inhibidor sobre los
microorganismos.
La reduccion de la actividad antimicrobiana
tambien revela cambios sutiles no comprobales
mediante metodos quimicos
Valoraciones microbiologicas siguen siendo la
metodologia que permite disipar dudas en
cuanto a la posible perdida de actividad de un
antibiotico

CONDICIONES
AMBIENTE
ASEPTICO que permita que los

procedimientos se realicen en
condiciones de higiene que
aseguren la no contaminacion
No es necesario realizar el
ensayo en una cabina de
Bioseguridad.
Cumplir con las BPL
Control microbiolgico del rea
de trabajo
Asignar un area especifica para
los ensayos de valoracion
microbiologica

AREA ASEPTICA

EQUIPOS
Todos los equipos

deben limpiarse bien


antes y despues de
cada uso.
Los equipos que lo
requieran deben ser
calibrados.
Los procesos de
esterilizacion en
horno y autoclave
deben ser validados.

EQUIPOS
Balanza analtica
Espectrofotmetr

o
Incubadora
Bao
termosttico
Halmetro
Vernier digital
Vortex
Refrigeradora

Espectrofotometria
Se requiere un

espectrofotometro
adecuado
Fuente luminosa que
permita longitudes de
onda 530 a 580 nm.
la espectrofotometra
visible solamente usa el
rango del campo
electromagntico de la luz
visible , de 400 a 800 nm.

Medir T o A
Met. Turbidimetrico
Conc. Inoculos

Materiales de vidrio
Los materiales de vidrio

utilizados para conservar y


transferir los organismos
de prueba deben
Ser esterilizados por calor
seco (Horno de
esterilizacion) o calor
humedo( autoclave)
El material de vidrio
graduado debe ser
calibrado

Placas Petri
Denominadas placas de

valoracion (USP 32)


Pueden ser de vidrio o
plastico
Dimensiones 20 x 100
mm
Deben ser nuevas sin
defectos ni rayaduras
Tener un procedimiento
de lavado adecuado
Se utilizan esteriles

PLACAS PETRI
Debern utilizarse
placas de vidrio o
desacartables con
dimensiones de :
20 x 100 mm

100 mm diametro

Otros materiales
Micropipetas
Volumenes ;
10 a 50 ul
100 a 1000 ul
Deben ser calibradas

CALIBRACION DE BALANZA
Se requiere que el

procedimiento de
pesada sea exacto.
Al pesar sales para
las soluciones
tampon
Pesar sustancias
antibioticas problema
Sustancias estandar
de referencia.

CONTROL DE
TEMPERATURA
Se requiere control
termostatico en varias
etapas de una
valoracion:
Cultivo de
microorganismos
Preparacion del inoculo
Incubacion de placas del
ensayo de valoracion
Es imperativo un control
estricto diario de la T
Valoracion 0.5 C

Estufas con circulacion de agua


Mayor capacidad termica y T
mas estable

Cilindros para valoracion


Cilindros de acero

inoxidable o
porcelana
Diametro externo de
8 mm.
Diametro interno de
6 mm
Longitud 10 mm

Tubos de prueba para


turbidimetria
Tubos de prueba de

vidrio o plastico
16 x 125 mm
18 x 150 mm
No deben tener
rayaduras ni defectos
Procedimiento de lavado
que elimine residuos de
antibiotico
Se deben esterilizar
antes de usar y luego de
usados antes de la
limpieza.

MEDIOS DE CULTIVO
Se encuentran en el

mercado en forma
deshidratada y se
preparan de acuerdo a lo
indicado por el fabricante.
La USP indica los
medios para cada
antibitico.
Deben pasar por la
prueba de promocin de
crecimiento, y la prueba
de esterilidad.

USP 32

Medios de cultivo
Los medios de

cultivo deben tener


certificados del
proveedor.
En lo posible se
debe trabajar con
medios de un mismo
laboratorio .

Medios de cultivo certificados

Laboratorios certificados
Formulas para

reconstituir
Preparan por
ingredientes

SOLUCIONES
AMORTIGUADORAS
Son soluciones de

sales de fosfato de
potasio.

Otorgan el pH optimo

para la actividad del


antibitico durante la
realizacin de los
ensayos.

La USP indica la

solucin
amortiguadora para
cada antibitico.

Preparacin de las soluciones


amortiguadoras
Utilizar sales qumicamente

puras y conservarse en el
desecador.
Las pesadas debern ser
exactas.
Debera utilizarse material
estril (fiolas, pipetas,
agua destilada y otros)
Las operaciones de la
disolucin se harn
aspticamente.
Las soluciones tampon se
esterilizan por filtracion o se
preparan con agua esteril.

IMPORTANTE RECORDAR
La medicion del pH
De las soluciones

tampon es un
rquisito
indispensable para la
disolucion y difusion
de las sustancias
antibioticas

ESTANDARES DE REFERENCIA
USP
denominados Estandares de Referencia Oficiales
Son sustancias de elevada pureza
Con caracteristicas esenciales
son sustancias cuya actividad ha sido
precisamente determinada con:
referencia a la Norma Internacional
correspondiente o
la Preparacin de la Referencia Internacional
USP, BP.

USO
Ayudan a garantizar

el cumplimiento de
los requisitos de
calidad oficiales de
USP-FDA
Se utilizan en las
valoraciones y
pruebas
farmacopeicas
contenidas en las
publicaciones de
Nornas oficiales.

Distribucion
La USP ofrece mas de

2200 estandares de
referencia
Productos
La USP colabora con la
OMS que tiene como
objetivo proporcionar

estandares biologicos
internacionales y
materiales quimicos de
referencia para
antibioticos,productos
biologicos y
quimioterapeuticos

Uso correcto de los


Estandares
Los Estandares de

Referencia no estan
diseadas para ser
utilizadas como
farmacos.
Los usuarios deben
asegurarse de la
aptitud para el uso

Almacenamiento
Deben almacenarse en

sus envases originales y


cerrados
Las condiciones de T y
Humedad se indican en
el certificado de cada
Estandar.
La exposicion a la luz es
importante cuando la
exigencia lo requiere.
Desecadores

Pesada
Asegurarse que los

Estandares de
Referencia sean
pesados con
exactitud

Secado
Cuando sea necesario

secar un Estandar
antes de usarlo.
Secar en un recipiente
limpio y seco y No en
el envase original.
Seguir indicaciones
especificadas en el
certificado

MICROORGANISMOS DE
PRUEBA
Las cepas a utilizar
deben ser:
Sensibles al
antibitico de
experimentacin
Resistentes a los
dems antibiticos

Deben ser
adquiridas:
American Type
culture
collection
(ATCC)
Deben ser
conservadas en el
medio indicado
segn la USP.

American Type Culture


Collection (ATCC)
es una entidad privada, mundialmente

reconocida como centro de recursos biolgicos,


cuya misin se centra en la produccin,
conservacin, y distribucin de patrones de
referencia de microorganismos.
Mercado dirigido para la investigacin y
laboratorios de control de calidad.
La coleccin de microorganismos ATCC,
incluye ms de 1800 cepas de bacterias de 900
gneros, as como 2000 diferentes tipos de
virus vegetales y animales.

Organismos de prueba para cada antibiotico

PREPARACION DEL INOCULO

PREPARACION DEL INOCULO


Seleccionar el

Propagar en

medio de cultivo.
Sembrar el m.o en
agar inclinado x
24 h a 30-35C
Cosechar el
crecimiento con 3
ml de S.S.F.

Frasco Roux
incubando a 30-35
C x 24h.
Cosechar con 50
ml de SSF.
Estandarizar
concentracin del
inoculo

SUSPENSION 10 8 A 10 9

CELULAS /ml

Incubacion
35Cx24h
100g
100g

Sembrar
m.o

Cosechar
m.o
3 ml ssf

Propagar
m.o
Incubacion
35Cx24h

Estandarizar
Concentracio
n
inoculo

Recordar :
El crecimiento y la

preparacion del
microorganismo
determinan el
estado fisiologico
de las celulas
Influencia directa
en el resultado de
los ensayos

ESCALA DE MAC FARLAND


.

Cl2Ba 1%

SO4H2 1%

u.f.c/ml

0,1

9,9

3,0x108

0,2

9,8

6,0x108

0,3

9,7

9,0x108

0,4

9,6

1,2x109

0,5

9,5

1,5x109

0,6

9,4

1,8x109

0,7

9,3

2,1x109

0,8

9,2

2,4x109

0,9

9,1

2.7x109

10

1,0

9,0

3,0x109

TUBO

METODOLOGIA
Segn:
Farmacopea Americana USP 32
Farmacopea Britnica 2009
Farmacopea Europea 2009
Tcnicas de Laboratorio de origen

METODOS
DIFUSION

TURBIDIMETRICO

METODO DIFUSION
Difusin del antibitico

contenido en un cilindro o
disco de papel de filtro a
travs de los medios de
cultivo.

adecuados en una extensin

tal que el microorganismo


agregado se inhiba de
crecer en la zona que rodea
al cilindro o disco de papel.
(ZONAS DE INHIBICION)

MATERIALES Y EQUIPOS
METODO DIFUSION
CILINDROS,acero
CILINDROS
inoxidable.
Dimetro externo
de 8 mm ( +- 0.1
mm)
Dimetro interno 6
mm (+- 0.1mm).
Longitud 10 mm
( +- 0.1 mm)

10 mm

Principio de la formacion de
zonas de inhibicion

Leyes que influencian la


difusion
Ley de la difusion
Ley del crecimiento microorganismos
Ley absorcion,permeabilidad y particion
Ley accion especifica del antibiotico

METODO CILINDRO PLACA

Se basa en la difusin del


antibitico desde un cilindro
vertical a travs de una capa de
agar.
De modo que el crecimiento
del microorganismo forma una
Zona de inhibicin alrededor
del cilindro conteniendo la
solucin del antibitico.

METODO DE EXCAVACION
PLACA CULTIVO
Se basa en la

difusin del
antibitico
contenido en
una excavacin,
a travs de una
capa de agar.

Formacion de

una zona de
inhibicion.

METODO TURBIDIMETRICO
Inhibicin del

crecimiento de un
cultivo microbiano en
una solucin uniforme
del antibitico, en un
medio fluido que
favorece su desarrollo
en ausencia del
antibitico.

MATERIALES Y EQUIPOS
METODO TURBIDIMETRICO
TUBOS
De longitud y
dimetros uniforme
Si son vueltos a
utilizar el lavado de
los mismos debe
ser eficiente
ESPECTROFOTOMETRO
530 nm . Hacer un blanco
con el medio de cultivo
no inoculado