C«ng nghÖ thu chÕ phÈm enzyme

Unit 4. C«ng nghÖ thu nhËn enzyme

4.1 Nguån thu enzyme 4.2 C¸c ph-¬ng ph¸p thu nhËn enzyme th« 4.3 Ph-¬ng ph¸p thu nhËn enzyme tõ thùc vËt vµ ®éng vË 4.4 C¸c ph-¬ng ph¸p thu nhËn enzyme tõ vi sinh vËt 4.5 C¸c ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy vi sinh vËt ®Ó thu nhËn enz 4.6 C¸c ph-¬ng ph¸p c¶i t¹o gièng vi sinh vËt ®Ó thu enzym

1. Nguån nguyªn liÖu thu enzyme. 
Enzyme lµ nh÷ng chÊt kh«ng thÓ ®iÒu chÕ ®-îc b»ng ph-¬ng ph¸p tæng hîp ho¸ häc.  Thu nhËn chóng tõ :  §éng vËt (8%)  Thùc vËt (4%)  Vi sinh vËt (>90%)

Enzyme ®éng vËt 
Tuþ t¹ng: amylase, maltase, lipase, cholesterol esterase, pectinase, nuclease, tripsin, chimotrypsin, cacboxyl peptidase A, B, elastase, D¹ dµy: Pepsin A, B, C, D, gastrinsin, celullase Ruét: enterokinase, latase, maltase, sacarase, nuclease, phosphatase, aminopeptidase, Gan : Urease TuyÕn n-íc bät: amylase, maltase, kalicrein HuyÕt thanh: amylase, phosphatase, transaminase

Enzyme thùc vËt 
§u ®ñ : papain Døa : bromelin Sung ; fixin Malt ®¹i m¹ch: amylase Gi¸ ®Ëu: Urease MÇm h¹t thÇu dÇu : lipase ChÌ : polyphenoxydase, protease, pectinase, amylase, invertase

Enzyme vi sinh vËt 
Nguån enzyme rÊt phong phó, ®a d¹ng, cã thÓ thu nhËn víi sè l-îng rÊt lín. HÖ enzyme vi sinh vËt cã thÓ thay ®æi b»ng c¸ch thay ®æi c¸c ®iÒu kiÖn nu«i cÊy. Vi sinh vËt cã kh¶ n¨ng ph¸t triÓn nhanh vµ sinh tæng hîp víi tèc ®é nhanh Enzyme vi sinh vËt cã ho¹t tÝnh m¹nh.

Mét sè quy tr×nh t¸ch, tinh chÕ enzyme thùc vËt & ®éng vËt.

T¸ch vµ tinh chÕ papain
Nhùa ®u ®ñ
0,001M EDTA 14% (NH4)2SO4 0,02M Cystein

Hoµ tan nhùa
1M NaOH

§-a pH=9
40% (NH4)2SO4

KÕt tña

Hoµ tan kÕt tña
1M NACl

KÕt tña

SÊy kh«

0,1 photphat buffer

T¸ch vµ tinh chÕ pepsin
Mµng nhµy d¹ dÇy Röa s¹ch

NghiÒn
5%HCl, 42oC, 42 g 22% NACl

Ph©n huû

Läc

KÕt tña

ChÕ phÈm

C¸c ph-¬ng ph¸p thu chÕ phÈm enzyme vi sinh vËt
Qui tr×nh s¶n xuÊt chÕ phÈm enzyme vi sinh vËt bao gåm c¸c giai ®o¹n chñ yÕu sau : Ph©n l©p, tuyÓn chän vµ c¶i t¹o gièng vi sinh vËt Nu«i cÊy vi sinh vËt sinh tæng hîp enzyme T¸ch vµ tinh chÕ enzyme

C¶i t¹o gièng vi sinh vËt §ét biÕn: ho¸ lý C¸c t¸c nh©n vËt lý: UV, X-ray, to, C¸c t¸c nh©n ho¸ häc ; c¸c chÊt g©y ®ét biÕ §ét biÕn b»ng ph-¬ng ph¸p sinh häc ph©n tö §ét biÕn ®iÓm Error-prone PCR Suffling  Ph-¬ng ph¸p biÕn n¹p  Ph-¬ng ph¸p tiÕp hîp gene  Ph-¬ng ph¸p t¶i n¹p

C¸c ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy vi sinh vËt Ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy trªn m«i tr-êng r¾n : Vi sinh vËt ph¸t triÓn trªn bÒ mÆt m«i tr-êng dinh d-ìng ë thÓ r¾n ®· ®-îc lµm Èm vµ v« trïng. Ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy trong m«i tr-êng láng : Vi sinh vËt ph¸t triÓn trong m«i tr-êng dinh d-ìng ë tr¹ng th¸i láng
Xem tiÕp ë file kh¸c

T¸ch vµ tinh chÕ enzyme
Khu tró cña enzyme : -Enzyme ngo¹i bµo: enzyme ®-îc tiÕt ra m«i tr-êng sèng cña sinh vËt. - Enzyme néi bµo : enzyme n»m ë trong tÕ bµo cña sinh vËt - Enzyme periplasmic : enzyme n»m ë mµng nguyªn sinh chÊt cña tÕ bµo.

C¸c ph-¬ng ph¸p ph¸ vì tÕ bµo
1. Ph-¬ng ph¸p c¬ häc : Ph¸ vì b»ng sãng siªu ©m : 18 kHz ± 1MHz Ph¸ vì b»ng m¸y ®ång ho¸ cao ¸p : 150 Mpa Ph¸ vì b»ng m¸y nghiÒn : víi c¸c h¹t cã r = 0,1 ± 0,2 mm Ph¸ vì b»ng ph-¬ng ph¸p l¹nh ®«ng

2. Ph-¬ng ph¸p phi c¬ häc Sèc thÈm thÊu : ®-êng 20% Xö lý kiÒm: pH 11,5 ±12,5 Sö dông chÊt tÈy röa : triton x100, tween 20, LAS Ph©n gi¶i b»ng enzyme

C¸c ph-¬ng ph¸p ®ång ho¸ TÕ bµo ®éng vËt (c¸c tæ chøc) -Nã rÊt dÔ ®ång ho¸ v× kh«ng cã vá tÕ bµo (cell wall) - CÇn ph¶i lo¹i bá mì vµ mµng tr-íc khi ®ång ho¸ Vi khuÈn vµ nÊm mèc CÇn ph©n huû vá tÕ bµo b»ng enzyme (cã thÓ t¹o tÕ bµo trÇn b»ng xö lý lysozyme hoÆc chitinase/3-glucanase) Thùc vËt - Ph¸ huû kh«ng bµo cã thÓ lµm háng enzyme

C¸c ph-¬ng ph¸p t¸ch KÝch th-íc vµ khèi l-îng Siªu ly t©m (300 000g) -Mr lµ yÕu tè chÝnh ®Ó t¸ch - Kh«ng hiÖu qu¶ ®Ó t¸ch enzyme tõ hçn hîp enzyme: th-êng ®Ó t¸ch chÊt bÈn Läc gel (Mr ~ hµng tr¨m ngµn) - Sephadex, Bio-gel P, Sephacryl, Sepharose- ®¾t ®á vµ tèn thêi gian. - Th-êng trong c«ng ®o¹n cuèi cña qu¸ tr×nh tinh s¹ch.

ThÈm tÝch (Mr ~ hµng chôc ngh×n) - Th-êng dïng ®Ó lo¹i muèi, dung m«i h÷u c¬,« Siªu läc -C¸c ph©n tö nhá ®-îc läc qua nhê ¸p lùc - Dïng ®Ó c« ®Æc protein

TÝnh ph©n cùc S¾c ký trao ®æi ion -TÝnh chÊt tÜnh ®iÖn -ChÈy qua ë nång ®é muèi thÊp vµ pH t-¬ng øng -Khö hÊp phô khi thay ®æi nång ®é muèi vµ pH -Enzyme cã thÓ t¸ch nhê ®iÒu kiÖn gradient -Cã thÓ ë quy m« lín -Th-êng t¨ng ®é tinh s¹ch 10 lÇn.

§iÖn di -T¸ch nhê chuyÓn ®éng cña c¸c ph©n t- tÝch ®iÖn -§iÖn di mao dÉn (<100 micromet) TËp trung ®¼ng ®iÖn (isoelectric focusing)` S¾c ký t-¬ng t¸c kþ n-íc (hydrophobic) - Phôc thuéc vµo bÒ mÆt cña c¸c aa kh«ng ph©n cùc cña e - Octyl- hoÆc phenyl-Sepharose cã lùc ion cao - Khö hÊp phô nhê lùc ion thÊp hoÆc bæ sung dung m«i h÷u

TÝnh tan * Thay ®æi pH - Enzyme Ýt tan ë pI bëi v× kh«ng cã lùc ®Èy gi÷a enzym - Enzyme kh«ng bÞ bÊt ho¹t ë d¶i pH *Thay ®æi trong lùc ion - C¸c ph©n tö cã ®iÖn tÝch lín rÊt Ýt tan trong n-íc tinh khiÕt; bæ sung c¸c ion lµm t¨ng tính hoµ tan (Salting in) - ¶nh h-ëng cña lùc ion, c¸c ph©n tö tÝch ®iÖn bÞ kÕt tña nhanh (Salting out) - Ammonium sulphate ®-îc -a dïng - T¨ng 10 lÇn møc ®é tinh s¹ch

Gi¶m h»ng sè l-ìng ®iÖn (dielectric constant) -Bæ sung dung m«i h÷u c¬ cã thÓ trén víi n-íc (ethanol, acetone) -Gi¶m h»ng sè l-ìng ®iÖn -§«i khi bÊt ho¹t enzyme -TiÕn hµnh ë nhiÖt ®é thÊp -Th-êng xö dông PEG ~ Mr 4000 ± 6000

VÞ trÝ liªn kÕt ®Æc biÖt -S¾c ký ¸i lùc - C¬ chÊt hoÆc chÊt øc chÕ liªn kÕt víi gi¸ thÓ - Ph¶n hÊp phô nhê sù ®Èy c¬ chÊt hoÆc thay ®æi pH, lùc S¨c ký ¸i lùc C¸c protein hçn hîp (fusing protein) -Glutathione-S-transferase: glutathione - Maltose binding protein:maltose -Hexahistidine:Ni2+ (t¸ch röa nhê imidazole hoÆc thrombine vÞ trÝ c¾t ®-îc bæ sung sau His-tag.

C¸c lo¹i s¾c ký kh¸c ¸i lùc t¸ch röa - Sau khi xuÊt hiÖn ë b-íc ph¶n hÊp thô - Cã thÓ gi¶i quyÕt mét sè vÊn ®Ò cña s¾c ký ¸i lùc vµ dÔ n©ng cÊp. S¾c ký dye ± ligand -Cibacron Blue F3G-A cã thÓ g¾n víi nhiÒu lo¹i dehydrogenase vµ kinase - Procion Red He-3B g¾n tèt víi NADP+ -tuú thuéc vµo dehydrogenase. S¾c ký hËp phô miÔn dÞch - Cè ®Þnh kh¸ng thÓ vµo Sepharose xö lý CNBr - §¹t ®-îc tinh s¹ch cao S¾c ký covalent - T¸ch cysteine chøa protein sö dông thiol-Sepharose 4B

C¸c d¹ng chÕ phÈm enzyme 
ChÕ phÈm th«: lµ chÕ phÈm ch-a ®-îc tinh chÕ. ChÕ phÈm kü thuËt : lµ chÕ phÈm ®· ®-îc tinh chÕ s¬ bé. ChÕ phÈm enzyme tinh khiÕt : ®· lo¹i protein vµ enzyme t¹p, chØ cßn mét enzyme mong muèn.

Ph©n ®o¹n & tinh chÕ enzyme (xem ë ch-¬ng tinh chÕ)

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful