Tinh chÕ enzyme

T¹i sao ph¶i tinh chÕ enzyme  Nã rÊt quan träng ®Ó nghiªn cøu enzyme trong hÖ thèng ®¬n gi¶n (víi c¸c ion, c¸c ph©n tö dung m«i, cofactor,« ) ®Ó hiÓu ®-îc cÊu tróc, ®éng häc, c¬ chÕ, sù ®iÒu hoµ cña nã vµ nhiÖm vô trong hÖ thèng phøc t¹p.  ViÖc tinh s¹ch enzyme lµ rÊt quan träng ®Ó sö dông nã trong c¸c môc ®Ých y häc vµ c«ng nghiÖp.

Môc ®Ých cña viÖc tinh chÕ enzyme Môc ®Ých: + N¨ng suÊt tèi ®a cã thÓ + ho¹t tÝnh xóc t¸c tèi ®a + TÝnh tinh s¹ch tèi ®a cã thÓ

Chän nguån thu enzyme
Ph-¬ng ph¸p cæ ®iÓn liªn quan tíi viÖc chän nguån cã nhiÒu enzyme. - Acetyl CoA carboxylase (mammary gland) -Alkailine phosphatase (kidney) C¸ch tiÕp cËn hiÖn ®¹i nhê kü thuËt t¸i tæ hîp -3-phosphoshikimate-t-carboxylvinyl transferase ë E. coli. (1984) - T¨ng n¨ng suÊt 100 lÇn Procaryon nh- lµ vsv chñ (E.coli, Bacillus) -Ph¸t triÓn nhanh vµ thµnh phÇn m«i tr-êng ®¬n gi¶n - BÊt lîi: thiÕu sù biÕn ®æi sau dÞch m· (glycosylation) vµ h×nh thµnh inclusion bodies

NÊm men nh- lµ nguån thu enzyme -S. cerevisiae Ýt h×nh thµnh c th vùi (conclusion bodies), nh-ng ph¸t triÓn chËm vµ t¹o ra hyperglycosylation. TÕ bµo c«n trïng nh- baculovirus vector -Cã thÓ sö dông nhiÒu sù biÕn ®æi protein, qu¸ tr×nh xö lý vµ hÖ thèng vËn chuyÓn trong c¸c tÕ bµo eucaryont bËc cao. ³Fusion protein´ -Glutathione-S-transferase, maltose protein liªn kÕt hoÆc His-tag ®-îc -a dïng - Lµm t¨ng ®¸ng kÓ lîi thÕ tinh s¹ch vµ ®«i khi c¶ tÝnh hoµ tan cña protein.

C¸c enzyme quan t©m ®-îc s¶n xuÊt ë chñng quen biÕt -Alkaline protease ho¨c a-amylase -> B. licheniformis, - Glucoamylase -> Aspergillus - acid cellulase -> Trichoderma - glucose/xylose isomerase -> Streptomyces

Separation process options Less specific methods
‡ centrifugation ‡ precipitation ‡ extraction ‡ filtration ‡ membrane microfiltration ‡ ultrafiltration

Separation process options

More specific methods ‡ adsorption ‡ gel filtration ‡ Special filtration steps ‡ Crystallization

C¸c ph-¬ng ph¸p tinh chÕ chñ yÕu

1.Ph-¬ng ph¸p kÕt tña (ammonium sulphate) 2.T¸ch dùa trªn kÝch th-íc ph©n tö (läc gel) 3.T¸ch dùa trªn ®iÖn tÝch (s¾c ký trao ®æi ion) 4.T¸ch dùa trªn sù t-¬ng t¸c ®Æc biÖt víi c¸c ph©n tö sinh sinh häc (s¾c ký bioaffinity) 5.T¸ch dùa trªn c¸c nguyªn lý kh¸c (s¾c

Lecture 4 Topic 4: Tinh chÕ enzyme Nguån enzyme ChiÕt T¸ch Purity & characterization 1. T¸ch b»ng kÕt tña a. KÕt tña muèi b. KÕt tña dung m«i h÷u c¬ c. C¸c chÊt polymer h÷u c¬ 2. Lo¹i muèi. a. B¸n thÊm b. Läc gel c. Siªu läc

T¸ch b»ng kÕt tña Nguån enzyme

T¹i sao? Nh÷ng lîi Ých

ChiÕt T¸ch Purity & characterization 

Lµm gi¶m thÓ tÝch chiÕt  §¹t ®-îc sù t¸ch tõng phÇn  Cã lîi cho b-íc tinh chÕ ban ®Çu

T¸ch b»ng kÕt tña nh- thÕ nµo 1. KÕt tña muèi * B»ng ammonium sulfate 2. KÕt tña b»ng dung m«i h-u c¬ * B»ng acetone 3. Polymer h÷u c¬ * B»ng polyethyneglycol (PEG)

KÕt tña muèi ammonium sulfate Enzyme bÞ kÕt tña ³salted out´ b»ng t-¬ng t¸c sî n-íc nh- thÕ nµo? Sù cã mÆt cña c¸c amino acid sî n-íc trªn bÒ mÆ Cña protein (nh- phe, tyr, leu, ile, met, val).

C¸c ph©n tö n-íc sÏ s¾p xÕp quanh patch h¸o n-íc cña protein

KÕt tña ammonium sulfate C¸c ph©n tö n-íc tù do s½n cã bÞ xua ®uæi khi muèi ®-îc bæ sung. Buéc n-íc ³frozen´ lo¹i bá C¸c vïng sî n-íc lé ra ngoµi vµ c¸c acid amin t-¬ng t¸c víi nhau KÕt côc lµ: * Protein kÕt hîp l¹i * Sù cïng kÕt hîp m¹nh h¬n trong chÊt chiÕt th«

C¸c ph©n tö n-íc sÏ s¾p xÕp quanh vïng sî n-íc cña protein

T¹i sao sö dông ammonium sulfate vµ kh«ng sö dông c¸c muèi kh¸c? 
Ammonium sulfate dÔ thu ®-îc ë tr¹ng th¸i tinh khiÕt vµ kh«ng ®¾t  Tan tèt trong n-íc (4M, dd muèi) æn ®Þnh protein (2-3M) Ng¨n ngõa proteolysis

KÕt tña ammonium sulfate ®-îc tùc hiÖn nh- thÕ nµo?
KiÓm tra thÓ tÝch t¸ch

TÝnh l-îng muèi cÇn thiÕt ®Ó ®¹t ®-îc kÕt tña muèi mong muèn

Ly t©m thu protein vµ hoµ tan trong mét Ýt buffer

Cho muèi tõ tõ vµo dÞch t¸ch khÊy liªn tôc; ®Ó dÞch t¸ch trong bÓ l¹nh

§Ó yªn dÞch t¸ch ®Ó protein kÕt tña hoµn toµn 

Lµm thÕ nµo ®Ó biÕt dung dÞch b·o hoµ

ammonium sulfate lµ phï hîp nhÊt ®Ó kÕt tña protein quan t©m?  Lµm thÕ nµo ®Ó biÕt sù kÕt tña ammonium sulfate dïng ®Ó kÕt tña mét phÇn protein cña chóng ta?

Chóng ta thùc hiÖn thö nghiÖm ®Çu tiªn sö dông c¸c d¶i muèi b·o hoµ kh¸c nhau 
0 ®Õn 20%  20 ®Õn 40%  40 ®Õn 60%  60 ®Õn 80%  80 ®Õn 100% ë mçi d¶i ph©n ®o¹n, x¸c ®Þnh l-îng protein thu ®-îc vµ ho¹t tÝnh enzym. Ph©n ®o¹n cã ho¹t tÝnh riªng cao nhÊt lµ enzyme mµ chóng ta muèn cã

TÝm sù ®iÒu chØnh tinh 
Dùa trªn sù t×m tßi ban ®Çu cña m×nh, chóng ta cã thÓ t×m d¶i ph©n ®o¹n tinh chØnh  NÕu chóng ta nghÜ r»ng protein/enzyme cã d¶i b·o trong kho¶ng 40 ±60%, chóng ta cã thÓ thö:  40 ®Õn 45%  45 ®Õn 55%  55 ®Õn 60%

B¶ng b·o hoµ ammonium sulphate
Init % 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 20 10.6 7.9 5.3 2.6 0 25 13.4 10.8 8.1 5.4 2.7 0 30 16.4 13.7 10.9 8.2 5.5 2.7 0 35 19.4 16.6 13.9 11.2 8.3 5.6 2.8 0 40 22.6 19.7 16.9 14.1 11.3 8.4 5.6 2.9 0 45 25.8 22.9 20.0 17.2 14.3 11.5 8.6 5.7 2.9 0 50 29.1 26.2 23.3 20.4 17.5 14.6 11.7 8.7 5.8 3.0 0 55 32.6 29.6 26.6 23.7 20.7 17.9 14.8 11.8 8.9 5.9 3.0 0 60 36.1 33.1 30.1 27.1 24.1 21.1 18.1 15.1 12.0 9.0 6.0 3.1 0 65 39.8 36.8 33.7 30.6 27.6 24.5 21.4 18.4 15.3 12.3 9.2 6.1 3.1 0 70 43.6 40.5 37.4 34.3 31.2 28.0 24.9 21.8 18.7 15.6 12.5 9.3 6.2 3.2 0 75 47.6 44.4 41.2 38.1 34.9 31.7 28.5 25.8 22.2 19.0 15.9 12.7 9.5 6.3 3.2 0 80 51.6 48.4 45.2 42.0 38.7 35.5 32.3 29.6 26.3 22.6 19.4 16.1 12.9 9.7 6.5 3.3 0 85 55.9 52.6 49.3 46.0 42.7 39.5 36.2 32.9 29.6 26.3 23.5 20.1 16.8 13.2 9.9 6.6 3.4 0 90 60.3 57.0 53.6 50.3 46.9 43.6 40.2 36.9 33.5 30.2 26.8 23.5 20.1 16.8 13.4 10.1 6.7 3.4 0 95 65.0 61.5 58.1 54.7 51.2 47.8 44.5 41.0 37.6 34.2 30.8 27.3 23.9 20.5 17.1 13.7 10.3 6.8 3.4 0 100 69.7 66.2 62.7 59.2 55.7 52.2 48.8 45.3 41.8 38.3 34.8 31.2 27.9 24.4 20.9 17.4 13.9 10.5 7.0 3.5 0

KÕt tña dung m«i h÷u c¬
C¸c dung m«i cã thÓ trén lÉn víi n-íc ®-îc (acetone, ethanol) Ho¹t tÝnh n-íc (water activity) sÏ gi¶m xuèng, t¹i sao?  Buéc cÊu tróc n-íc quanh c¸c vïng sî n-íc thay thÕ c¸c ph©n tö dung m«i h÷u c¬  Lµm cho c¸c vïng ®ã cã tÝnh hoµ tan t-¬ng ®èi cao KÕt côc lµ: lµm gi¶m tÝnh hoµ tan cña c¸c protein cã thÓ hoµ trong n-íc, dÉn ®Õn:  sù kÕt hîp vµ kÕt tña c¸c ph©n tö lín kÕt tña tr-íc hÕt  do c¸c lùc tÜnh ®iÖn vµ ph©n cùc, van der waals

Chän dung m«i  Cã thÓ trén hoµn toµn víi n-íc  Kh«ng ph¶n øng víi protein  Cã hiÖu øng kÕt tña tèt Cã 2 lo¹i dung m«i th«ng dông Acetone  Ethanol

KÕt tña polymer h÷u c¬ Polyethyleneglycol  PEG 6000 hoÆc 20000  Thµnh c«ng lín nhÊt víi c¸c protein Ýt tan §iÒu bÊt lîi  Khã lo¹i bá PEG  Nång ®é PEG thÊp còng lµm h- hai ho¹t tÝnh cña enzyme

Lo¹i muèi CÇn thiÕt b-íc nµy v× c¸c lý do sau:  Cã thÓ liªn quan tíi viÖc thö nghiÖm ho¹t tÝnh sinh häc  Cã thÓ liªn quan tíi c¸c b-íc tinh chÕ ®ßi hái nång ®é lùc ion thÊp trong mÉu  S¾c ký trao ®æi ion  chromatofocusing  §iÖn di dù bÞ (preparative electrophoresis)

Cã nh÷ng ph-¬ng ph¸p g× ®Ó lo¹i muèi? 1. ThÈm tÝch sö dông tói cellulose 2. Läc gel sö dông ph©n tö gel sµng (sieve gel) 3. Siªu läc qua hÖ thèng mµng

Tãm l-îc 1. B-íc ®Çu tiªn th-êng ®-îc sö dông sau khi chiÕt t¸ch protein lµ ®Ó lµm gi¶m thÓ tÝch cña mÉu b»ng kÕt tña muèi 2. C¬ së chÝnh cña b-íc nµy lµ kÕt tña protein. 3. Lo¹i bá muèi sau khi thùc hiÖn b-íc nµy cã thÓ lµ cÇn thiÕt vµ cã thÓ ®¹t ®-îc b»ng thÈm tÝch vµ läc gel

Xö lý nhiÖt Trong nhiÒu tr-êng hîp, ho¹t ®éng cña c¸c enzyme kh«ng cÇn thiÕt cã thÓ ®-îc lo¹i bá b»ng viÖc xö lý nhiÖt. NhiÒu enzym kh¸c nhau cã tÝnh nh¹y c¶m do biÕn tÝnh nhiÖt vµ cã sù kÕt tña kh¸c nhau. §Ó lo¹i bá c¸c enzyme kÐm chÞu nhiÖt ra khái hån hîp víi enzyme chÞu nhiÖt th× yªu cÇu tr-íc tiªn lµ c¸c enzyme ph¶i t-¬ng ®èi chÞu nhiÖt. Tinh s¹ch c¸c enzyme chÞu nhiÖt ho¹t ®éng cho phÐp dÔ dµng vµ nhanh chãng. §èi víi c¸c enzym nh- vËy viÖc xö lý nhiÖt lu«n ®-îc xem nh- mét sù lùa ®Çu tiªn trong tinh s¹ch enzyme. Ph-¬ng ph¸p ®Æc biÖt nµy ®· ®-îc ¸p dông thµnh c«ng cho s¶n xuÊt glucose isomerase, trong ®ã nhiÖt ®é ®-îc sö dông mét c¸ch t-¬ng ®èi cao (lµ 60 ± 85oC trong 10 phót).

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful