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9.

Espectrofotome
tra
de
fluorescencia

LUMINISCENCIA MOLECULAR

I. Fluorescencia

Foton
II. Fosforescencia es
III. Quimioluminiscencia

Rx.

Fluorescencia
Excitado

1
Fundame
ntal

1 2
=
Fluorescen
cia de
resonancia

Fluorescencia
Excitado

1
Fundame
ntal

1 2
<
Desplazami
ento de
Stokes

Estados singulete y triplete

Singulete
Fundame
ntal

Singul
ete
Excita
do

Triplet
e
Excita
do

FOSFORESCENC
FLUORESCEN
CIA
IA

Absorcin y emisin energa


radiante

Procesos de desactivacin
Relajacin vibracional
D
q
D
q

D
A

q
D

D
D

Absorcin y emisin energa


radiante

Procesos de desactivacin
Conversin interna

Excitado
2

-E

Excitado
1

Niveles
energticos
prximos

Solapamiento
niveles
vibracionales

Procesos de desactivacin
Conversin interna

Conversin interna
predisociacin

Excitado
2

Energa
equivalente a
enlace dbil

Excitado
1

Procesos de desactivacin
Conversin interna
vibracional

Relajacin

Excitado
2

Excitado
1

Fundame
ntal

Procesos de desactivacin
Conversin interna
vibracional

Relajacin

Espectros de excitacin y emisin de una


disolucin de quinina

Absorcin y emisin energa


radiante

Procesos de desactivacin
Cruce entre sistemas
Singulete
*
Triplete*

Br, I, O 2

lo
favorecen

Factores que afectan la


fluorescencia

Rendimiento (o eficiencia)

cuntico(a) =
fotones
= fluorescentes
fotones totales
absorbidos
Estructur
Ambient
a

TRANSICIONES
ELECTRNICAS
E
Singulete*/Trip
lete*

kces- * < kcesn*

ces = cruce entre


sistemas

1000
100 X
*
t1/2 10-9 10-7 s

X*
t1/2 10-7 10-5
s

ESTRUCTURA,
condensacin anillos

Piridina
Furano

Quinolina
Indol

Tiofeno

ESTRUCTURA, sustituyentes

n - * < *

Tomado de Skoog y

ESTRUCTURA, rigidez

1.0

0.2

Conversi
n
interna

DISOLVENT
E

CH3CH2 - I

pH,
resonancia

Sustituyentes cidos (o
bsicos), estado inico =

CONCENTRACI
N
A

q
A
q

A
A

A
A

q
A
q

autoamortigua

CONCENTRACI
N
A

autoabsorcin

emis =
cte.

RFU

Intensidad

ESPECTROS EXCITACIN Y
EMISIN

exc
Grfica A. Espectro
de excitacin

exc =
cte.

emi
Grfica B. Espectro
de emisin s

ESPECTROS EXCITACIN Y
EMISIN

ESPECTROS EXCITACIN Y
EMISIN

Grfica C. Espectro de excitacin-emisin


del complejo DNA-verde SYBR

Instrumentaci
n fluorometra

INSTRUMENTOS DE DOBLE HAZ

Tomado de Skoog y cols (5

ESPECTROFLUORMETRO

Monocroma
dor de
excitacin

Arco Xe, arco


Hg,
Xe-Hg;
lser
Fotomultiplicad
ores
(alta
sensibilidad)

Monocroma
dor de
emisin

aplicacion
es

ANLISIS CUANTITATIVO
OH
OH
N=N

Al, F-

Zr y Sn

SO3N
a
Granate de alizarina R

Riboflavina (vit
B2)

ANLISIS CUANTITATIVO

ADRENALIN
A

ANLISIS CUANTITATIVO
Ejemplo: 1 muestra de 1 g de cereal se trat
con cido y una pequea cantidad de KMnO4
para oxidar la riboflavina (Rb) presente. El
exceso de KMnO4 fue eliminado con H2O2.
La disolucin anterior se transfiri a un
matraz de 50 mL y se diluy hasta la marca.
Una alcuota de 25 mL de esta disolucin se
transfiri a una celda, se agreg una pequea
cantidad de ditionita de sodio para convertir
la Rb-oxidada a Rb y se ley la fluorescencia
relativa, en un equipo previamente ajustado

La lectura de intensidad de emisin relativa,


registrada como RFU en el equipo fue de 6
unidades para el blanco y 65 unidades
para la muestra.
Una segunda de 24 mL tomada a partir de la
disolucin de la muestra oxidada, se adicion
con 1 mL de una disolucin estndar de Rb de
0.5 g/mL.
Esta alcuota se transfiri a una celda
equivalente a la empleada para el blanco y la
muestra sin adicin de estndar, y fue tratada
con ditionita de sodio para obtener Rb. La
lectura de esta fue de 95 unidades.

ANLISIS CUANTITATIVO
Ejemplo 2: una pastilla antimalaria es
analizada
para
determinar
la
concentracin
de
quinina.
Para
tal
propsito una tableta de 1.644 g se
disuelve en HCl 0.1 M en un matraz
volumtrico de 500 mL.
Con una pipeta se transfieren 15 mL de la
disolucin anterior a un matraz aforado de
100 mL, y se diluyen con cido hasta la
marca.

Posteriormente, una disolucin patrn de


quinina de concentracin equivalente a
100 ppm proporciona una lectura de 180
unidades, cuando es tratada y leda bajo
las mismas condiciones que la muestra
problema.
Calcular la masa, en mg, de quinina
presente en la tableta farmacutica.

ANLISIS CUALITATIVO
Fluorocromo: marcador colorante
con capacidad de fluorescer al ser
excitado a una en particular.
Fluorforo:
grupo funcional de
una molcula (fluorocromo) que le
imparte
la
propiedad
de
fluorescencia.
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MO
NOWEB/capitulo6

ANLISIS CUALITATIVO

http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MO
NOWEB/capitulo6

ANLISIS CUALITATIVO

Fig. I. Espectros excitacin emisin:


Espectro excitacin (lnea continua) y espectro de
emisin (lnea punteada) de fluorescena y
rodamina.

Microscopia de fluorescencia

DAPI: azul
GFP: verde
RODAMINA:
rojoII.
Fig.
Clula en

Procesos celulares

Fig. III. [Ca2+]. Gradientes de Ca2+ en un leucocito,


monitorizados con Fura 2 (izquierda). Modificacin gradiente de
Ca2+ por quimiotaxis (derecha)
Tomado de Lodish y cols. Biol. Celular y
Molecular (5 edic)

Expresin gnica

cDNA =
Texas-red
Genoma =
FITC

Fig. IV. Perfil de expresin gnica, anlisis


Tomado de Corvaln A.tumoral
(2006). Perfiles de expres. gnica en decisiones

FOSFORESCEN
CIA

FOSFORESCENCIA
Procesos de desactivacin. Cruce
entre sistemas

Fosforescencia, caractersticas
Probabilid
ad

Singulet
e*
Triplete*

t1/2 10-4
10s

Requiere
:
T
viscosidad

Quimioluminiscencia

Luminol
(qumica
forense)

Deteccin de
restos de
sangre

Quimioluminiscencia
Rx
qumic
a

energa

luz

Analito

Quimioluminiscencia
Determinacin N
orgnico:
1100 C
muestra

NO +
O3
LUZ
+
NO2

Quimioluminiscencia
+
NO
CO2
-

CO2
-

catalizad
or

N2
+

luz