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MYCOBACTERIUM

TUBERCULOSIS

Mycobacterium
tuberculosis
Agente
etiológico de la
tuberculosis

HISTORIA

El hallazgo de tuberculosis evidente
en los huesos de algunas momias
egipcias indica que es una
enfermedad antigua.

1484-1553 Francostorius llegó a
algunas conclusiones sobre la
naturaleza de la infección y su
mecanismo de transmisión.

HISTORIA    1865 Willemin es cuando transmitió la enfermedad del hombre a los conejos. 1878 Baumgarten vió el bacilo en los tejidos infectados 1882 Roberto Koch es quien aisló el bacilo tuberculoso .

HISTORIA POSTULADO DE KOCH     Encontró el bacilo asociado constantemente a la enfermedad Aislo en cultivo puro Reprodujo la enfemedad en conejos y cobayos con el cultivo Recuperó el bacilo en cultivo puro de los animales infectados .

bovis. excepcionalmente.La tuberculosis     Es una enfermedad infecciosa causada por Mycobacterium tuberculosis y. . por M. También puede afectar a otros órganos. El curso de la enfermedad es crónico y puede conducir a la muerte si el paciente no recibe tratamiento. Se caracteriza por la formación de granulomas en los tejidos.

Epidemiología Existen evidencias paleológicas de tb en restos neolíticos precolombinos y egipcios. • En los siglos XVII y XVIII la Tb fue responsable de una cuarta parte de todas las muertes en adultos en Europa. • Se convirtió en un problema grave en el momento del hacinamiento en los medios urbanos asociado con la Revolución Industrial y generó circunstancias epidemiológicas que favorecieron su propagación. • .

tuberculosis. que hay 30 millones de enfermos en el mundo y que se producen al menos 10 millones de nuevos casos al año. • . • Se estima que la mitad de la población mundial está infectada por M.Epidemiología La aparición del SIDA ha supuesto un resurgimiento excepcional de esta enfermedad en todo el mundo.

3. que se caracteriza por: 1. 2.   La propiedad ácido alcohol resistente. La lentitud con que se desarrolla en los medios de cultivo La exigencia de que estos medios sean altamente nutritivos para desarrollarse. Se conocen mas de 100 especies Viven en el medio ambiente .Las Micobacterias  Son microorganismos de forma bacilar.

Características de la micobacterias no  Han sido identificadas más de 50 patógenas especies  Interfieren con la interpretación en la rx de tuberculina .

Interfieren con la evaluación de la
eficacia de los programas de
vacunación BCG

Pueden aparecer ocasionalmente
en la expectoración, en orina o en
otras muestras orgánicas

Propiedades Biológicas de
Mycobacterium
 Es un parásito estricto, por lo cual su
tuberculosis

transmisión generalmente es directa, de
persona a persona.
No tiene toxinas conocidas, ---capacidad
de bacteriostasis por largos períodos en
el interior de las células.
Es aerobio, lo que determina que tenga
una capacidad de metabolización y de
crecimiento muy diferentes según la
tención parcial del oxigeno del órgano o
lesión en que anida.

Es de multiplicación lenta, factor que
condiciona su tendencia a la cronicidad.
Tiene una virulencia variable, que podría
explicar algunas de sus características
epidemiológicas.
Tiene numerosos antígenos, capaces de
despertar una gran variedad de respuestas
inmunológicas en el huésped, algunas de
las cuales determina el característico daño
tisular que es capaz de producir.

2-0.5 m Pared celular-lípidos (>60%) glicolípidos y proteínas Presencia de ac. Micólicos típicos. fagocitosis y el Complemento.     ( 78 a 90 átomos de carbono ) Estos son el 50% del peso de la pared.Morfologia     Forma bacilar Longitud de 2-4 micras y diametro 0. que las hace mas virulentas Previenen los ataques por lisozima. Son muy hidrofobicos. .

no móviles Aerobios Forman filamentos ramificados Crecen lentamente muy exigente en nutrición Resistencia a detergentes Resistencias a los antibióticos .         Factor Cordon forma las serpentinas. Bacilos con capacidad de acidorresistencia No esporulados . este es toxico para las células infectadas.

Pequeña tumefacción o tubérculo.De importancia medica :  Mycobacterium tuberculosis: Tuberculum. relativo a la lepra . en referencia a la formación de tubérculos en los pulmones de los pacientes infectados  Mycobacterium leprae : lepra.

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luz solar. es ACIDORRESISTENTE por la composición de su pared celular. Resistente al frío. . congelación Resistente a la desecación Sensible al calor.Mycobacterium tuberculosis     No es Gram Positivo ni Gram Negativo. luz UV.

 Muchas micobacterias pueden formar parte de nuestra flora normal (en varias partes del cuerpo). .

Mycobacterium tuberculosis .

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Resistencia a lisis ( Complemento). Resistencia a los antibióticos.Lípidos Mycobacterium tuberculosis asociados a:      Impermeabilidad a colorantes. Resistencia a oxidación y sobrevivencia dentro de Macrófagos. Resistencia a ácidos y álcalis. .

reservorios de M. bovis Monos. Ovinos=reservorios de M. perros gatos. tuberculosis complex.Tuberculosis Reservorios son los humanos. .

toser etc. cantar. al Reír. Bacilos llegan al alveolo en condiciones ideales: con una elevada tensión de O2 .Mecanismo de transmisión    Vía aerógena. El enfermo elimina microgotas (aerosoles)..

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Transmisión aérea .

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Después de 4 semanas el sistema inmune monta una respuesta celular La gran cantidad de células mononucleares en pulmones forman los tubérculos característicos .Tuberculosis    La dosis infectante es de 10 células bacterianas.

Patogenia   Las bacterias son pulsadas en gotitas de saliva. las gotitas se evaporan y por su pequeñez después de inhalados pueden ser depositados en los alveolos. El SI del huésped reacciona con liberación de citosinas y linfocinas que estimulan a monocitos y macrófagos .

  Las micobacterias comienzan a multiplicarse dentro de macrófagos Después de uno a dos meses de la exposición aparecen en los pulmones las lesiones patógenas propias de la infección .

la lesión en tej. Pulmonar se asemeja a un cuadro de neumonía. presencia de PMN y monocitos alrededor de los bacilos . edema. pero puede originar necrosis masiva de tej y transformarse en una lesión productiva .  Lesión Tipo exudativo: Es una reacción inflamatoria aguda. con liquido. Esta lesión puede desaparecer porque el exudado es absorbido .

    Lesión Tipo productivo: Es un granuloma crónico . comprende tres zonas: 1. 2. una zona central de grandes células gigantes multinucleadas que contienen bacilos. una zona periférica de fibroblastos. que puede curar por fibrosis o calcificación . este puede romperse y vaciar su contenido en un bronquio y formar una cavidad. linfocitos y monocitos La zona central presenta necrosis caseosa y recibe el nombre de tubérculo . una zona media de células epiteliodes dispuestas en forma radiada 3.

grandes macrófagos y rodeados de fibroblastos. linfocitos.Los tubérculos son granulomas    Que contienen a las bacterias en el centro. . y neutrófilos. Puede quedarse así o hacerse necrótico caseoso y curar lentamente calcificándose La respuesta celular es la que se mide con la tuberculina.

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el paciente presenta variedad de síntomas. Con mal tratamiento o sin tratamiento tiene 60% mortalidad. Aquí el bacilo se multiplica y llena los bronquios. .Tuberculosis secundaria El bacilo puede despertarse mucho tiempo después de latencia.

cerebro. meninges y otros. riñones.Tuberculosis extrapulmonar En la TB secundaria el bacilo puede invadir : nódulos linfáticos. tracto genital. huesos. .

Presente Tuberculina.test positivo  TB pulmonar M.Infección nfermo TB Infección M.TB.TB.normal  Baciloscopia y cultivo=negativo  Baciloscopia y cultivo positivos  Síntomas: tos. fiebre. Presente Tuberculina test positivo  Rayos-X= lesion  Rayos-X. perdida de peso  Infeccioso antes de tratamiento  No infeccioso  .

Diagnóstico de laboratorio  Muestra Esputo  Microscopia  Cultivo  Sensibilidad a fármacos .

Reactivos:    Fucsina fenicada (CARBOLFUCSINA) Alcohol ácido (HCL + ETANOL) Azul de metileno .Coloración Ziehl Neelsen  Las pared celular micobacteriana. la cual tienen la capacidad de combinarse con el colorante carbolfuscina resistiendo la decoloración con alcohol ácido. tienen un alto contenido lipídico.

000 bacilos / ml de esputo Necesita de personal entrenado Control de calidad .000 a 10.Coloración Ziehl Neelsen     Sensibilidad 50 a 80 % Es necesario 5.

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BACILOSCOPIA Informe de resultados Se recomienda la siguiente escala semicuantitativa: NEGATIVA POSITIVO 1+ POSITIVO 2+ POSITIVO 3+ No se observan BAAR en 100 campos 1 BAAR / campo en 100 campos observados. Más de 10 BAAR / campo en 20 campos . De 1 a 10 BAAR / campo en 50 campos observados.

CULTIVO DE MYCOBCTERIUM TUBERCULOSIS .

Medios de cultivo Medios a base de huevo :  Lowestein Jensen  Stonebrink  Ogawa Kudoh Medios semisintéticos:  7H10  7H9  7H11 .

    Se puede aislar en al menos dos medios de cultivo: -Middlebrook's medium -Lowenstein-Jensen medium las colonias se observan a las 4-6 semanas .

Mycobacterium tuberculosis  Crecimiento aerobio a 37 ·C. . 6 semanas.

rugosas de aspecto de coliflor y de borde irregular .LECTURA E INFORME   El desarrollo de M. Las colonias típicas son de color crema. secas. Tuberculosis generalmente aparece luego de 2 a 3 semanas.

 La Pared celular posee peptidoglicanos pero en su mayoría compuesta por lípidos ( especial entre Procariotas)  El 60% son lípidos  Ácidos Micólicos (únicos de micobacterias y corinebacterias) .

Resistencia a lisis ( Complemento). Resistencia a oxidación y sobrevivencia dentro de Macrófagos. Resistencia a ácidos y álcalis.Lípidos Mycobacterium tuberculosis asociados a:      Impermeabilidad a colorantes. . Resistencia a los antibióticos.

IMPORTANCIA DEL CULTIVO  La importancia radica en aislar a M. a fin de identificar la cepa y realizar las pruebas de sensibilidad a los medicamentos antituberculosos. tuberculosis a partir de muestras de escasa cantidad de bacilos en pte con sospecha de tuberculosis y radiografía anormal. .

Dx de TBC infantil baciloscopías negativa DX de tuberculosis extrapulmonar.Aspectos generales e En el dx diferencial de tubeculosis indicaciones del cultivo pulmonar de sintomáticos respiratorios      con dos baciloscopías negativas y cuadro clínico –radiológico sospechoso. Para estudios de sensibilidad En pacientes HIV positivas/SIDA .

tuberculosis . En muestras de escasos bacilos (1-9 BAAR en más de 100 campos observados) Para estudios epidemiológicos de resistencia primaria y secundaria a M.Aspectos generales e indicaciones del cultivo    Pacientes multitratados con persistencia de baciloscopía positiva.

LECTURA E INFORME - No se observan colonias (negativ o) No.. + ++ +++ CC Número total de colonias si < de 20 De 20 a 100 colonias Colonias separadas más de 100 Colonias confluentes (desarrollo en toda la superficie del medio) Cultivo contaminado ..

OTRAS TECNICAS DIAGNOSTICAS DE TUBERCULOSIS .

.OTRAS TECNICAS DIAGNOSTICAS DE TUBERCULOSIS  Métodos de cultivo radiométrico     (BACTEC) Métodos químicos Detección de anticuerpos Determinación de antígenos bacterianos Métodos de recombinación de los ác nucleicos.

Técnicas inmunológicas *Métodos serológicos   Identificar Acs dirigidos contra antígenos específicos de la micobacterias (ELISA) Detección directa de Ags micobacterianos en suero o secreciones .

vacuna     Disponible la vacuna contra la tuberculosis. BCG . La BCG bacilo de Calmette – Guerin Recomendada a países en desarrollo.

 Estreptomicina (no en foto) se inyecta según el CDC. pirazinamida. .Drogas para tratamiento de TB Isoniazida. y ethambutol. rifampicina.

alimentación y seguridad socialeconómica.Prevención y control   Higiene Buenas condiciones de vivienda. .

Gracias! .

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Coloración Ziehl Neelsen Procedimiento:       Cubrir el frotis con fucsina ácida y calentar la lámina hasta obs. Lavar con agua y dejar secar al aire Observar la microscopio 100x . Cubrir con azul de metileno durante 1 min. desprendimiento de vapores por tres veces.(tiempo min 5 minutos) Lavar con agua corriente Decolorar con alcohol ácido x 2 min.

TINCION DE KINYOUN  No utiliza el calor para favorecer la captación de la fucsina fenicada.  Tinción fría. técnica igual que ZN .

TINCION CON FLUOROCROMOS  Se basa en el mismo principio de coloración de ZN.  . se observa fluorescencia amarilla naranja cuando se observa en campo oscuro  Es una técnica rápida.recomendable para laboratorios que tienen grandes cantidades de muestras El los casos en que la morfología de los bacilos encontrados por es esta tecnica es cuestionable se debe repetir con ZN para disminuir falsos positivos.

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Orina: Se solicita la totalidad de la primera micción de la mañana. recogida después de un esfuerzo de tos.Se solicitan tres muestras debido a que la elimación del bacilo es variable.Recolección de muestra   Expectoración (esputo) : proveniente del arbol bronquial. . Se sugiere cultivar por lo menos tres muestras seriadas.

Recolección de muestra   Secreciones: Las muestras se extraen con hisopos estériles.Se extrae fragmentos de tejido a estudiar se deposita en un vial estéril sin conservadores. enviandose dentro de un tubo estéril y con el otro se realiza un frotis para coloración ZN Biopsias:La obtención lo realiza el médico. . Conservar en refrigeración.

.Materiales de biopsia pleural. hepática y ganglionar: se fraccionará con instrumento quirúrgico estéril en una mortero de porcelana estéril se agrega una suspensión de agua estéril y se siembra en el medio de cultivo. puede cultivarse prescindiendo de la descontaminación: -Muestras obtenidas por punción: LCR.Procesamiento de la muestra Las muestras obtenidas asépticamente. Se centrifuga y se siembra el sedimento. peritoneal. pleural. articular. .

deben ser descontaminadas antes del cultivo.Procesamiento de la muestra    Las muestras contaminadas: esputo. descontaminar y sembrar. entre otras. Se deberán centrifugar al volumen total a 3000 ó 3500 RPM durante 20 a 30 min. Eliminar el sobrenadante. contenido gástrico. orina. .

Procesamiento de la muestra  La descontaminación se realiza con hidróxido de sodio (NaOH) al 4%. Tuberculosis. . material celular y tejidos. cuyos gérmenes se multiplican más rápido que el bacilo. soluc acuosa estéril. También para homogenizar la muestra especialmente el esputo a fin de liberar al bacilo del mucus.  Objetivo: eliminar la flora asociada a M.

Están constituidos por: -soluciones reguladoras a base de fosfatos.Medios de cultivo   Medios a base de huevos: Se obtiene medios ricos en lípidos por la que la micobacteria tiene especial preferencia. -cationes en muy bajas concentraciones -una fuente de carbono (glicerol) -otra fuente de nitrogeno (asparagina)-Lowestein Jeinsen -o una fuente de ambos elementos (piruvato) medio de Stonebrink -verde de malaquita como descontaminante .

aminoácido (digerido anzimático de caseína) y asparagina. Acidos grasos de cadena larga (ac. glicerol o glucosa. Oléico alcance concentraciones tóxicas.Medios de cultivo    Medios semisintéticos de aislamiento y subcultivo El medio basal está constituido por elementos inorgánicos. Oléico por ejemplo) Seroalbumina previene que el ac. .

Lowestein Jensen

Solución de sales:
fosfato monopotásico
-sulfato de magnesio

-citrato de


magnesio
-L-asparagina
-glicerina bidestilada
Suspensión de huevos enteros
Solución acuosa de verde de malaquita al 2%

-

Medio ogawa

Solución de sales:
-fosfato monopotásico
glutamato de sodio
-glicerol
-agua


destilada
-glicerina bidestilada
Suspensión de huevos enteros
Solución acuosa de verde de malaquita al 2%

CULTIVO EN MEDIO
OGAWA ACIDIFICADO



Colocar en un tubo 1 ml de muestra de
esputo o todo el sedimento obtenido por
centrifugación. Agregar 4 ml de solución
estéril de NaOH al 4%.
Dejar a 37C x 20 min en estufa o BM
Neutralizar
Homogenizar la muestra con un pipeta e
inocular 0.1 ml en 2 tubos de medio de
ogawa, bañando toda la superficie del
medio.

CULTIVO EN MEDIO OGAWA ACIDIFICADO      Colocar los tubos en bandejas de fondo inclinado e incubar en estufa a 37C Después de 48h revisar los tubos y ajustar las tapas. El desarrollo de colonias antes de las 48h es indicativo de contaminación. Verificar si algún tubo está contaminado: Alcalinizado (color blanco amarillento) o acidificado(color azul oscuro) por mala neutralización de la muestra. aveces el medio se licua por acción de gérmenes proteolíticos. .

si es BAAR se envia el cultivo para su tipicación. 30 y 60 días Las colonias no típicas se hace frotis y coloración ZN .LECTURA E INFORME   Las lecturas se realizarán durante la incubación a los 7. .

en la que se investiga velocidad de desarrollo y la producción de pigmentos. Se completa con las pruebas bioquímicas. .TIPIFICACION DE MICOBACTERIAS   La preclasificación según Runyon.

kansassi I-Fotocromogenas RUNYON M.fortuitum M. vaccae . gordonae M.escrofulaceum M. bovis M. xenopi M. tuberculosis M.avium M. marinum CEPAS DE DESARROLLO LENTO (días o más) Pigmentan por estímulo de la luz II-scotocromogenas Pigmentan sin necesidad del estimulo de la luz III No cromógenas No pigmentan  espontáneamente ni por estímulo de la luz     CEPAS DE DESARROLLO RAPIDO (7 días o menos) IV-Crecimiento rápido Pueden pigmentar o no M. simiae M.        Clasificación de micobacterias según M.phlei M.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS  Se fundamenta en la capacidad que tienen algunas especies de micobacerias de transformar un producto en otro diferente mediante la acción de enzimas. .

africanun - - - - v + - M. . bovis² M.Pruebas bioquímicas Especie Niacina Reducción de nitratos Hidrolisis Tween 80 Catalasa 68ºC THC Ureasa Crecimiento en PZA + + +/- - + +/- - - - - - - + + bovis BCG² - + +/- - - + + M. tuberculosis M.avium complex¹ - - - + + - + M.

Esta niacina es un producto metabólico que forman las bacterias. -Bromuro de cianógeno 4-10% -solución alcohólica de bencidina o anilina al 4% . acumulandose por tanto en el medio (positivas). Reactivos .PRUEBA DE LA NIACINA   Permite identificar a las especies que carecen de la enzima que transfoma la niacina en niacina ribonucleótide.

luego se extrae el líquido con una pipeta a otro tubo donde se le agrega 0.5 ml de cada rvo. Reacción positiva: aparece de inmediato una coloración violácea (bencidina) o amarilla(anilina) .se deja en reposo minimo 15 min.PRUEBA DE LA NIACINA   En un cultivo abundante se agrega 1ml agua dest .

Se realiza en cultivos que tengan menos de 1 mes Reactivos:-sol.085% -reactivo de Griess .acuosa 0.01M de nitrato sodio 0.PRUEBA DE NITRATO REDUCCION    Permite identificar a especies que contienen la enzima nitroreductasa.

Luego se agrega el reactivo de Gries 0.se agrega 10 ml de solucion de nitrato de sodio y se incuba 2 horas a 37C. .PRUEBA DE NITRATO REDUCCION  En un tubo se mezcla 4 gotas de agua dest con 10 mg de masa bacilar.2 ml de A y B se agitar y leer inmediatamente.

Tuberculosis (positivo) .PRUEBA DE NITRATO REDUCCION      Lectura: reacción positiva: coloración roja Reacción dudosa: coloración rosada Reacción negativa: sin coloración o rosa pálido. Realizar dos controles uno en un tubo con el sustrato solamente (negativo) y otro con cultivo joven de M.

nombre comercial del detergente monoeleato de polioxietilen sorbitan .  Reactivos:tween 80.PRUEBA DE HIDRÓLISIS DE TWEEN 80  Permite diferenciar a micobacterias que hidrolizan el Tween80 mediante la enzima lipasa en ácido oléico y sorbitol polioxietilado sorbitan. rojo neutro y solución reguladora de fosfato Ph 7  Tween 80.

Leer a los 5 y alos 10 días Es positivo si hay un cambio de color de ambar a rosa salmón. sin contacto con la luz. no más de 2 semanas. Incubar a 37C. Informar positivo a los 5 días o positivo a los 10 días.PRUEBA DE HIDRÓLISIS DE TWEEN 80     Se suspende en el sustrato colonias de cultivo joven en medio sólido. el color puede intensificarse a rosado más intenso y hasta rojo neutro. .

descompone el H2O2 en agua y oxígeno libre. La semicuantificación y la suceptibilidad al calentamiento son útiles para identificar a las micobacterias. .PRUEBA DE LA CATALASA 68C   La catalasa es una enzima producida en cantidades variables.

5 ml en tubos y agregar una asadita cargada de colonias tomadas de un cultivo joven. Tween y agua oxigenada.agua oxigenada 110 vol (H2O2 al 30%) -Solución reguladora de fosfáto pH 7 -Tween 80 Distribuir la sol reguladora 0.PRUEBA DE LA CATALASA 68C   Reactivos:.5 ml de mezcla de sol. Agregar al tubo o. . Colocar el tubo en baño de agua termoregulado a 68C x 20 min.

PRUEBA DE LA CATALASA 68C  Lectura: observar formación de burbujas en a superficie. Obs 20 min antes de informar resultados negativo. .

.Técnica de cultivo radiométrica (bactec)     Tiene alta sensibilidad y especificidad que los método tradicionales Permite el dx de tuberculosis en menos de 1 sem en el 95% de los casos también util para realizar sensibilidad de la cepa y obtener resultados en pocos días Ayuda en la diferenciación de otras especies de micobacterias.

Palmítico con carbono 14 (isótopo radioactivo) Las micobacterias vivas metabolizan los ac.Técnica de cultivo radiométrica (bactec)   Medio de cultivo Middlebrook enriquecido. de donde es aspirado y llevado a una cámara ionizante y transformado en una corriente eléctrica proporcional a la cantidad de bacilos.libran el isotopo en forma de CO2 marcado con C14 al medio ambiente . Medio rico en ac. . graso con C14.

capaz de aumentar la señal a 1 millon de veces. Actualmente se utiliza HPLC. .Técnicas Químicas *determinación de constituyentes micobacterianos:   Acidos micólicos en LCR.la cual detecta cantidades infimas de sust quimicas. Acido esteárico en secreciones. . medición en pocas horas.

Técnicas Químicas *Determinación de derivados del metabolismo de la enfermedad tuberculosa:  Medición de la actividad de la enzima adenosina deaminasa (ADA) Enzima proveniente del metabolimo de las purinas que se encuentra en exudados proveniente de pleuresia. peritonitis y meningitis tuberculosas. pericarditis. .

Técnicas inmunológicas *Métodos serológicos   Identificar Acs dirigidos contra antígenos específicos de la micobacterias (ELISA) Detección directa de Ags micobacterianos en suero o secreciones .

 Se busca nuevos marcadores de la aciv. Tuberculosa.Técnicas inmunológicas *Métodos de recombinación genética de acidos nucleicos-clonaciónhibridación Detección de secuencias especiales de ADN o ARN micobacteriano en expectoración u otras muestras orgánicas. Es prometedor la medición de interluquina 2 en cual se encuentra elevado en granulomatosis y otra enf que activan los linfocitos T .

LOCALIZACION .

TRANSMISIÓN   .