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Esterilizao de meios de cultura

e equipamentos de fermentao
Introduo:
Esterilizar significa remover todas as
formas de vida da superfcie ou interior de um
equipamento;
Pode ser feita mtodos fsicos calor
seco e mido, radiao UV, gama e ultra-som;
Mtodos qumicos lquidos ou gases,
hipoclorito, xido de etileno, oznio, dixido
de enxofre.

Significado dos diversos processos:


Desinfeco processo menos rigoroso
com auxlio de agentes qumicos (germicida
ou desinfetante);
Anti-sptico agente qumico que
destri microrganismos, um desinfetante;
Assepsia a contnua remoo de
patognicos ou indesejveis de um ambiente
ou objeto;
Processos industriais usam vapor para
esterilizao de meios e equipamentos.

Modo de atuao:

calor mido desnaturao


irreversvel das protenas , como as enzimas;
calor seco elimina microrganismos
pela oxidao de seus constituintes qumicos
luz ultravioleta absorvida de modo
significativo pelos cidos nuclicos, leses
entre 220 a 300 nm;
radiaes ionizantes como alfa ( )
e gama ( ), raios X levando inviabilidade
da molcula de DNA.

xido de etileno agente alquilante,


substituindo H das protenas e cidos
nuclicos por EtO;
Agentes fsicos calor mido em
processo descontnuo 121o C e contnuo em
trocadores de calor;
calor seco vidraria a 150o C;
Radiaes UV vidraria e embalagens
Raios Gama Co 60 e Ce 137;
Agentes qumicos quando
equipamentos no admitem esterilizao
por vapor;
sanitizantes lquidos ou germicidas;

Os germicidas qumicos podem ser:


de alto nvel destroem esporos de
C. botulinum. Ex. H2O2 de 6 a 30%;
nvel intermedirio destroem mofos
e leveduras. Ex. soluo hidroalcolica 70 a
90%;
nvel baixo destroem clulas
vegetativas, mas no os esporos. Ex.
compostos quaternrios de amnio 0,1 a
0,2%.

Clculos de esterilizao:
A ao do calor mido elimina os
microrganismos numa velocidade que est
relacionada:
com microrganismo gnero,
espcie, linhagem, idade, esporos;
com meio de cultura
composio, pH, slidos em suspenso;
com temperatura do processo;

A morte do microrganismo num meio com


temperatura superior letal pode ocorrer
por:
ativao da molcula pela
energia trmica;
oxignio;
dgua;

reao da molcula com


reao molcula com vapor

Todas as reaes ocorridas pela ao do


calor mido so reaes qumicas de 1a
ordem.

Assim, considerando que, em temperatura


constante e taxa de morte de 1a ordem:

No: no inicial de microrganismos

viveis;

N: no de microrganismos viveis aps

tempo t;

N: no de microrganismos mortos

aps tempo t;

Tem-se a seguinte relao:

dN
'
k ( N o N )
dt

(1)

dN
k .N
dt

(2)

Sendo a temperatura constante, a integrao


da equao (2) entre No para t= o e N para
t=t, tem-se a relao:

No
ln
k .t
N
ou

N
k .t
ln
No

ln N ln N o k .t

(3)

A relao

N
No

Significa a frao de microrganismos viveis


aps um tempo t de tratamento trmico,
sendo k uma constante dependente da
temperatura de tratamento.
A figura a seguir mostra o grfico que
obtido se um grande nmero de bactrias for
submetido a um tratamento trmico.
A ordenada logartmica e a abscissa linear

N
ln
No

k .t

Esta equao no admite a reduo do


nmero de microrganismos a zero, pois se N
chegar a zero, o tempo de tratamento ser
infinito;
Entretanto, isso obtido na prtica dentro de
um determinado perodo;
O que esta equao realmente indica?

Para valores de N menores do que 1 no h


N
problema, pois N representa a frao de
microrganismos viveis aps um tempo t;
o

Supondo que N = 0,1 aps um tempo t de


tratamento;
No se pode considerar que um dcimo
(1/10 ou 0,1) de microrganismo sobreviver
Mas sim que h a probabilidade de que 1 em
10 microrganismos sobreviver.

K constante de destruio trmica,


funo da temperatura para um
microrganismo;
Em temperatura constante possvel
determinar N a partir da equao (3);

ln N ln N o k .t
A partir de valores de N obtidos em
diferentes tempos, pode-se calcular k;
Na prtica industrial no se pode
considerar somente o tempo na temperatura
de esterilizao.

Nos processos em batelada devem ser


considerados tambm os perodos de
aquecimento e resfriamento do meio;
O valor da constante k ir variar com a
temperatura, de acordo com a equao de
Arrhenius:

d ln k
E

dT
RT 2

E
ln k C
RT

E: energia de ativao
R: constante dos gases
T: temperatura absoluta
C: constante de Arrhenius

(4)

Valores de k em diversas temperaturas, se


plotados como ln k x 1/T geram linha reta
cuja inclinao ser E/R;
De onde se poder calcular a energia de
ativao do microrganismo;
A interseco da reta no eixo ln k dar o
valor de C a constante de Arrhenius;
Considerando a curva temperatura x tempo,
ter-se- a seguinte curva

Deve ocorrer morte trmica nos perodos AB


(aquecimento) e CD (resfriamento);
A seo BC o perodo de manuteno na
temperatura de esterilizao Ts;
No havendo danos ao meio de cultura podese desconsiderar os perodos de aquecimento
e resfriamento;
Mas se considerar, haver reduo do tempo
BC, pela ao letal nos dois perodos
considerados.

Para destruir esporos de um microrganismo


precisaremos conhecer:
E (energia de ativao);
C (constante de Arrhenius);
Pois estes parmetros caracterizam a
destruio trmica de um microrganismo.
Ento, a partir da equao k A.e

E
RT

Pode-se construir um grfico k x T para a


faixa de atuao.

Definindo o valor (nabla) como:

NO
ln

Considerando que o processo de esterilizao


de 1a ordem, tem-se:

dN
k .N
dt
Integrando, tem-se:
NO
ln

N

k .dt

Pela definio de

(A)

NO
ln

E a equao de Arrhenius

k A.e

(B)
E
RT

(C)

Combinando (A), (B) e (C), ter-se-:


=A.

E
RT

.dt

Em temperatura constante:
=k.T = A . T .

E
e RT

Exemplo: esterilizar 1.000 L meio com No = 103


esporos/mL. Nmero total de esporos 109 esporos.
Probabilidade de 0,001, ou 1 esporo vivel em
1.000, logo N = 10-3.
Pode-se escrever:

N0
109
12

10
N
10 3

Como:
=

N0
12
12
ln

ln
10

2
,
303
log
10
27,64

O valor de para todo o processo ser 27,64 mas


parte da populao microbiana cair no perodo de
aquecimento e resfriamento.
Desta forma:
total = aquecimento + esterilizao + resfriamento
Para determinar os valores no aquecimento e
resfriamento, deve-se integrar a equao:
t

A. e
0

E
RT

.dt

Para resolver analiticamente conhecer a


relao matemtica entre temperatura e
tempo para as curvas de aquecimento e
resfriamento;
Da equao:
= k . t = A. t.

E
RT

O perodo de permanncia na temperatura


constante dado por:
=k.t
De onde se pode o tempo na temperatura
constante;
O valor de k na parte de aquecimento tem
que ser calculada pelo mtodo grfico.

No grfico temperatura x tempo cada degrau


pode ser considerado estar em T constante;
Dessa forma, obtm-se valores de para
cada um deles, onde t o intervalo de tempo
escolhido;
1 = k1 .t

2 = k2 . t .......n = kn . t etc.

Para o primeiro degrau:


N0
1 = ln N
1

Onde N1 a populao reduzida ao fim do


tempo na temperatura T1;

Da mesma forma para o segundo degrau:


N1

N
2

= ln

Dessa forma:
1 + 2 =

N 0 N1
N 0 N1
N0
ln
x ln

ln

N
N
N
N
N
2
1 2
1
2

A soma do valor dos de cada degrau da


curva de aquecimento dar o valor total do
do perodo de aquecimento;
Assim na curva de aquecimento (fig. 7.1),
sendo NA e NB os nmeros de microrganismos
nos pontos A e B, respectivamente, ter-se-:

aquecimento =

ln

NA

NB

= 1 +2 + 3 + etc

Ex. 12.000 L meio aquecido de 55o a 121o C,


com No = 2 x 1010 esporos/L e probabilidade
de sobrevivncia de 1 esporo em 1.000.
Isto levou a um de 40.
Mas integrao de curvas de aquecimento e
resfriamento levou aos valores:
aquec. = 9,8
resfr. = 10,1
A permanncia na temperatura de 121o C ser
de 40 19,1 = 20,1

Consideraes sobre clculo do tempo de


esterilizao
Da expresso ln N = ln No k . t
obtm-se:
1 N0
t ln

k N

(3)

Sabendo valor de k calcular t necessrio


para reduzir No at o valor N;
Mas a aplicao dessa equao para calcular
o tempo de esterilizao no simples;
Pelos seguintes motivos:

1)Os meios de cultura no tem s um tipo de


microrganismo;
2) K tambm funo da composio do meio
portanto o microrganismo escolhido precisa
ter um k neste meio e nesta temperatura;
3) As clulas podem se agregar ou ficar
protegidas por partculas em suspenso,
aumentando sua termo resistncia;

4) A prpria definio de esterilizao, em


que o N = 0 no fim do processo, tornando
impraticvel esta equao.
O item 4) pode ser resolvido pela aplicao
da probabilidade de falha da esterilizao;
Sendo:
Et = no total de esterilizaes realizadas;
= no de esterilizaes que falharam;
A probabilidade de falha (P) ser:
P=

Ef
Et

Ef

Multiplicando por 100 falha em percentagem


Ex. No = microrganismos vivos em lotes de
meios;
100No = microrganismos em 100 lotes;
H trs lotes que no sero esterilizados;
A condio necessria e suficiente para que
falhe a esterilizao um microrganismo vivo;
Nmero final de microrganismos vivos = 3
(um em cada lote que a esterilizao falhou);
Aplicando a equao

1 N0
t ln

k N

Ao conjunto dos 100 lotes

Teremos

1 100 N 0
1 N
t ln
ln

k
3
k 0,03
De um modo geral, sendo P a probabilidade
de falha, pode-se escrever:

1 N0
t ln

k
P
Ex. Um volume de meio contm 2,5 . 1010
microrganismos vivos e k = 3,4 min-1.
Calcular os tempos de esterilizao para que
as probabilidades de falha sejam 0,1, 0,01 ou
0,001.

Para P = 0,1 ou 10%


2,5.1010
1
t
ln
7,7 min
3,4
0,1

Para P = 0,01 ou 1%
2,5.1010
1
t
ln
8,4 min
3,4
0,01

Para P = 0,001 ou 0,1%


2,5.1010
1
t
ln
9,1 min
3,4 0,001