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Introduccin a la

Fluorescencia
Abril, 2012

Antes que todo


recordemos que

Fsica de la
Fluorescencia
2

S1

Energia

S1
hex
()

S0
Palabras clave:

hem
()

3
longitud de
onda larga

S0

Transicin, estado excitado,


energa absorbida, estabilidad.
3

Estado
de
excitaci
n

Estado
fundamental

Produccin de la
Fluorescencia

Conceptos y terminologa
importante
Espectro
de excitacin:
Es la representacin del nmero de fotones absorbidos por una
molcula con su correspondiente longitud de onda.
Espectro de emisin:
Representacin de los fotones liberados al pasar del estado de
excitacin al estado fundamental donde los electrones son
estables.

GFP & Variantes de Curvas


de Fluorescencia

GFP (Green Fluorescence Protein): Es una protena


que se utiliza en biologa molecular habitualmente
como marcador.
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Microscopa de Fluorescencia

Microscopa de Epifluorescencia
Fue descubierto en 1908 por Khler y
Siedentopf.
Las molculas absorben luz en una cierta
longitud de onda y emiten luz en otra longitud
de onda ms larga.
Los colorantes fluorescentes utilizados para la
tincin celular se denominan fluorocromos
fluorforo (hechas a base de protenas).
La intensidad y el color de la luz de emisin es
una propiedad caracterstica de la molcula
fluorescente utilizada.
No pueden ser observados durante 8largo

Ventajas
Permite un alto constraste entre la seal (lo que
interesa) y el ruido (lo que no interesa).
Se puede utilizar anticuerpos dirigidos contra
una protena lo que permite ubicarla en una
clula.
Versatilidad de estudiar funciones y procesos
en clulas vvas

Componentes
El cubo filtro de Fluorescencia

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ComponentesEl cubo filtro de Fluorescencia


Por ejemplo:
Cubo filtro I3, datos tcnicos: excitation filter BP 450/490, dichromatic
mirror: 510, suppression filter: LP 515
Filtro de Excitacin
Selecciona la luz de la longitud de onda incidente. Para el ejemplo dejar
pasar las longitudes en el rango desde 450-490 nm (color azul)
Espejo dicroico
Este espejo tienen la propiedad de reflejar la luz de ciertas longitudes de
onda y de dejar pasar otras, p.e. reflejar longitudes de onda 510nm
menos (azul) y dejar pasar longitudes superior a 510nm (verde) emitida
por el fluorocromo de la muestra.
Filtro de emisin
Selecciona la luz fluorescente que pasar p. e. dejar pasar la longitud de
onda 515nm (verde)

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Componentes
El cubo filtro de Fluorescencia
-Las rendijas del filtro de excitacin han de ser lo
suficientemente estrechas como para obtener un espectro bien
resuelto.
-Los espectros de emisin a menudo son acompaados por otras
emisiones indeseables que dificultan el estudio aqu el filtro
supresor adquiere importancia.
-Existe un gran nmero de juegos de filtros de excitacin y
emisin para los diferentes fluorocromos, hay algunos que
permiten la observacin simultnea de dos o tres fluorocromos.

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Componentes
Fuente de luminacin
Lampara Halgena
Lmpara de arco de alta presin de Xenn (Xe)
Lmpara de baja presin vapor de Mercurio (Hg)
Lampara de Halogenuros Metlicos
LED
Lo ideal es tener una fuente de radiacin potente que emita de
manera continua sobre un amplio intervalo espectral

Componentes

Objetivos
-A mayor A.N. mayor
fluorescencia ser captada

Resolucin ptica: Convencional (Tambin llamado WideField)


vs. Confocal

Confocal Microscopy

Patented by Minsky in 1957


Eliminacin de planos fuera
de enfoque observados en
fluorescencia

http://www.atto.com/Carv/CarvSkinSection.htm
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Configuracin
Cubo Filtros
- Preguntar que sondas o fluorocromos utilizarn en sus estudios
estos pueden ser: Isotiocianato de fluorcena, DAPI, naranja
de acridina, etc.
El FITC es ampliamente utilizado en microscopa de fluorescencia
acoplada a anticuerpos. Entre FITC y DAPI (usado para AND)
estn casi el 80% de las aplicaciones.
-

ncontrar la correspondencia entre los fluorocromos y los


cubos filtros (Tabla).

De acuerdo a la cantidad de cubos filtros a utilizar seleccionar


el modelo del microcopio. DM750/1000 cuando sean como
mximo 02 cubos filtros, DM2000/2500/3000/4000 y DMI3000
para mximo 04 cubos filtros, DMI4000/6000B para 05 cubos,
DM5000/5500/6000 hasta 07 cubos filtro.

Configuracin
Cubo Filtros
DAPI, tie el ADN,
permite ubicar
clulas por sus
ncleos pero no
distingue clulas
muertas de clulas
vivas.
FITC
Conjugado ms
empleado para ver
reacciones antgenoanticuerpo.

Fuente de Iuminacin
Fuente de luminacin
Es necesario tener en cuenta tres componentes importantes:
-Intensidad de la lmpara
-Distribucin de longitudes de onda de la radiacin que emite la
fuente
-Estabilidad

Configuracin
Fuente de luminacin

Lampara Halgena
Lmpara de arco de alta presin de Xenn (Xe)
Lmpara de baja presin vapor de Mercurio (Hg)
Lampara de Halogenuros Metlicos
LED

Configuracin
Lmparas de arco de alta presin de Xenn
Emiten una radiacin relativamente estable de flujo contnuo
entre 300 a 1300 nm, estn limitados por el desgaste del
electrodo y la divagacin del arco.

Configuracin
Lmparas de vapor de Mercurio de baja presin
Son los ms frecuentemente utilizados, el arco resultante es difusa
y mucho menos intensa pero con mejor estabilidad en
comparacin al arco de Xenn una radiacin intensa y
relativamente estable de flujo contnuo entre 300 a 1300 nm,
esta limitado por el desgaste del electrodo y la divagacin del
arco.
Son de alto costo y requieren ser centrados continuamente, no se
puede regular la intensidad de luz, corto tiempo de vidal til (200
horas), requiere tiempo de espera para conexin/desconexin.

Configuracin
UV
334

UV
365

Viol
405

Azul
436

Verde
546

Amarillo
578

100,0%
90,0%

FITC

80,0%

Power [mW]

70,0%
60,0%
HBO

50,0%

HXP120

40,0%
30,0%
20,0%
10,0%
0,0%
250

300

350

400

450

500

550

Lambda [nm]

600

650

700

750

Configuracin

Configuracin
Accesorios
- Cmaras digitales
- Software
- Otros componetes (Disponible desde DM4000
en adelante)

Requerimientos para la
digitalizacin de la Fluorescencia
Adquisicin activa de..
Secuencia rpida de imgenes

Bajo nivel de ruido con alto


rango dinmico
Extraer seales dbiles

Binning
Incrementar sensibilidad

Sub-region de exploracin
Aumenta la velocidad, menos
dao a la muestra

Respuesta Extendida
Mayro opciones de fluorocromos

DFC310FX

DFC345FX

DFC365FX

Configuracin
Accesorios
- Cmaras
Aplicaciones de Fluorescencia en General

DFC450
DFC450 C
DFC495
DFC500

Configuracin
Accesorios
- Software
Cuando y por que utilizarlo ?
Uso creciente de la microscopia de
fluorescencia en biociencias.
La adquisicin de imgenes digitales en
fluorescencia es especial ya que los
especimenes frecuentemente no son estables
y las imgenes pueden perder intensidad
Esto hace a la fotografa tradicional compleja y
poco conveniente
La imagen digital produce imgenes en un
formato que puede manipularse fcilmente
para identificar detalles y que es adecuado
para medidas y anlisis

Configuracin
Accesorios
- Software
Superposicin de Imgenes LAS
Mdulo opcional que combina con un
microscopio de fluorescencia Leica, una
cmara digital y una PC
Optimizado para adquisicin de imgenes
multicanal para
Visualizacin, mejora, documentacin de imgenes
fluorescentes coloreadas de microscopia

Las imgenes de los distintos canales se


combinan en una imagen Superposicin
coloreada
Ejecuta el proceso de forma simple,

Configuracin
Accesorios
- Software
Superposicin de Imgenes LAS

Uso adecuado
Interfaz de usuario Leica estndar
Puede recombinar imgenes de canales para obtener
el aspecto necesario (utiliza desde 2 hasta 8 canales)
Puede adquirir mltiples canales y combinar slo los
deseados
Puede utilizarse tambin con DIC o BF
Se muestra la imagen a tiempo real durante el ajuste
Fcil composicin de la imagen y ajuste de la cmara
(los tiempos de exposicin se ajustan por separado
para cada canal)
Recuperacin de datos de configuracin
Reproducir adquisiciones es simple

Otros componentes

Lente de refuerzo para


incrementar la intensidad
FIM (Fluorescence Intensity
Manager) Gestor de Intensidad de
la Fluorescencia para cambiar la
intensidad de luz sin perder
contraste.
Gestor de Excitacin para ajuste
de intensidad de diferentes
longitudes de onda.
Diafragma de campos
rectangulares para ptima seal
de ratio de ruido en imgenes
digitales.

Fluo Booster
Lente deslizante opcional
Incrementa la intensidad de
luz hasta 30%
Puede ser cambiado para
alta homogeneidad o alta
intensidad.

FIM
Gestor de Intensidad de la Fluorescencia
(Fluorescence Intensity Manager)
Atenuacin de la intensidad de luz
fluorescente
Evita los efectos de desvanecimiento
Gives less stress to living cells or
organisms
5 posiciones: 100%, 55%, 30%, 17%,
10%
La atenuacin se asigna directamente
a los cubos filtros

Color
Gestor de Excitacin
(Exitation Manager)
Control deslizante Opcional
Ajuste de intensidad a
diferentes longitudes de onda
Para balance verde/rojo
durante la estimulacin
simultnea.

Fin