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CULTIVO IN VITRO DE

CLULAS Y TEJIDOS
VEGETALES

INTRODUCCIN
Es un mtodo de propagacin
asexual
Se obtiene plantas:
Genticamente idnticas entre s y con
planta madre
Limpias de patgenos
A gran escala

Sirve para:
Propagacin de variedades lite
Mejoramiento in vitro
Introduccin de genes forneos (Ingeniera
Gentica)

INTRODUCCIN
En qu consiste:
Tomar una parte de la planta (explante)
En condiciones aspticas
Introducirla en recipiente con medio de
cultivo
Inducir brotacin, elongacin y crecimiento
Inducir enraizamiento
Adaptar a las condiciones externas
Transferir a macetas en invernadero
Transferir al vivero y al campo

INTRODUCCIN

FACTOR
TRANSCRIPCIN

CASCADA

mRNA

En qu se basa?
En la totipotencia de las clulas
vegetales

PROTEINAS

Cada clula posee el genoma completo


Capacidad de regenerar plantas completas
Solo se requiere reprogramar los genes

Cules clulas son totipotentes?


Todas las clulas que posean el genoma
completo
Entre ms jvenes ms fcil reprogramar
sus genes
Clulas muy viejas o muertas pierden

RECEPTOR

HORMONA

INTRODUCCIN
Orden de totipotencialidad
Meristemos
Embrin
Yemas apicales y axilares
Partes jvenes de hojas, peciolos, tallos,
races, pednculos, ptalos
Partes adultas
Clulas muertas:
Esclernquima
Tubos cribosos
Trqueas y traqueidas

INTRODUCCIN
Dos tipos de explantes:
Meristemtico
Embriones, yemas
Fcil propagar
No se requiere incluir reguladores de crecimiento
en el medio de cultivo, porque posen un balance
hormonal endgeno adecuado
Estn activados los genes de la divisin celular
(mitosis)
Estn activados los genes de la organognesis

INTRODUCCIN
Dos tipos de explantes
Diferenciados o adultos
Requieren una fase de desdiferenciacin
(callo)
Reprogramacin de genes
Activacin de genes de mitosis
Activacin de genes de morfognesis

INTRODUCCIN
Clula meristemtica vs. Clula
adulta
Ncleo central grande
Nucleolo voluminoso
Relacin nucleoplsmica elevada
Vacuolo reducida
Numerosas mitocondrias
Ausencia de plastos diferenciados

INTRODUCCIN
Diferenciacin y desdiferenciacin
Diferenciacin

Embrionarias
Hormonas

Desdiferenciaci

INTRODUCCIN
Aplicaciones:
Cultivo de segmentos nodales
Cultivo de meristemos yemas limpieza de virus
Cultivo de explantos sin yemas (organognesis)
Variacin somaclonal

Embriognesis somtica
Cultivo de protoplastos
Cultivo de clulas en suspensin
Cultivo y rescate de embriones
Cultivo de anteras y microesporas
Cultivo de semillas de orqudea
Produccin de metabolitos secundarios
Conservacin de germoplasma in vitro

Establecimiento de un laboratorio de
cultivo de tejidos

Disposicin del
laboratorio
Alejado de caminos de alto trfico
Alejado de corrientes de aire
Alejado de otros laboratorios de
insectos o microorganismos
Alejado de almacenes de semillas u
otro material vegetal

Cuidados
Mantenerlo siempre limpio
No tener plantas dentro del
laboratorio
Fuente de caros y otros contaminantes

Ducharse y cambiarse de ropa antes


de ingresar luego de haber trabajado
en invernadero y campo

reas del
rea
rea
rea
rea
rea
rea

de
de
de
de
de
de

laboratorio

preparacin
lavado y esterilizacin
transferencia (inoculacin)
incubacin
observacin y Examen
oficina

INVERNADEROS
rea de crecimiento
rea de cuarentena y control fitosanitario

V AF

Sala de
siembra II

V
A
F

Sala de
incubacin
Sala de
siembra I

REAS DE LAS
Almacn

QUE CONSTA UN
LABORATORIO
DE CULTIVO DE
TEJIDOS

V
A
F

Sala de
lavado,
secado y
esterilizado

Oficina

Sala de
preparacin
de medios
de cultivo y
tejidos

Antesala

V
A
F

Oficina y antesala
Son reas en las cuales cualquier
persona puede ingresar ya que no
tienen condiciones aspticas.

Sala de lavado
1. Para lavar la cristalera en general
2. Tambin para el 1er. lavado con detergente
del material vegetativo.

Sala de lavado
Debe haber el siguiente material:
- cristalera
- gabinetes con puertas para la cristalera
- estufa de secado por conveccin
- autoclave
- agua caliente y fra
- destilador y desionizador de agua
- fregadero
- instalacin elctrica 110 y 220 V.

SALA DE PREPARACIN DE MEDIO Y


MATERIAL VEGETATIVO
Debe haber el siguiente material:
- gabinetes para los reactivos y materiales
- cnulas para esterilizar cajas de Petri
- vehculo para transportar materiales y soluciones
- agitadores magnticos con calentamiento
- reloj alarma de 120 min.
- balanza analtica
- potencimetro
- refrigerador y congelador
- instalacin de gas e instalaciones de vaco

SALA DE INOCULACIN O SIEMBRA


En esta sala se debe mantener asepsia mxima, se emplea
cmaras de flujo laminar
utensillos estriles,
cubrebocas, gorras, zapatos, y
aire acondicionado y filtrado
estereomicroscopio
instalacin de gas
instrumentos de diseccin
lmpara de luz ultravioleta

CMARA DE FLUJO LAMINAR

Area de siembra
bbbb

OPERADOR

SALA DE SIEMBRA COMERCIAL

SALA DE INCUBACIN
Las diferentes fases de crecimiento de los inculos
necesitan diferentes foto-perodos, temperatura,
intensidad lumnica, etc.
Debe tener:
- aire acondicionado 22-28 C
- Regulador de fotoperodo: 16 luz, 8 oscuridad
- anaqueles

Area de incubacin y
crecimiento

rea de incubacin y crecimiento

ALMACN
1.
2.

Para guardar reactivos y cristalera


Debe haber baja humedad relativa y baja temperatura

INVERNADERO
- regulacin de luz, tanto en intensidad como en
fotoperodo
- regulacin de la temperatura
- control de humedad
-

pisos de concreto
exclusin de insectos (mosquiteros)
sistema de nebulizacin
fertilizacin e irrigacin automtica
mezcla de suelos estriles

INVERNADERO

VIVERO

MEDIOS DE CULTIVO
Mezcla de sales minerales
Macronutrientes: N, P, K, Ca, Mg, S
Micronutrientes: Cu, Fe, Mn, Co, Cl,

Fuente de carbono (energa)


Sacarosa
Glucosa

Vitaminas
Reguladores de crecimiento
Agua
Otras sustancias

MEDIOS DE CULTIVO
Objetivo
Crear condiciones nutricionales,
ambientales , pH y de osmolaridad para
el crecimiento de plantas in vitro

Medio de Cultivo Murashige y Skoog (1962)


SALES
CONCENTRACIN
STOC
INICIAL g/l
K
Final mg/l

I
II

III

IV

NH4NO3

82.5

KNO3

95

MgSO4. 7H2O

18.5

MnSO4. H2O

0.845

ZnSO4. 7H2O

0.43

CuSO4. 5H2O

0.00125

CaCl2. 2H2O

22

KI

0.0415

CoCl2.6H2O

0.00125

KH2PO4

8.5

H3BO3

0.31

Na2MoO4. 2H2O

0.0125

1650
1900
370
16.90
8.9
0.025
440
0.83
0.025
170
6.2
0.25
27.8
37.3

VITAMINAS:
CONCENTRACIN INICIAL Y FINAL
VITAMINAS

C. INICIAL

C. Final
mg/l

cido Nicotnico B

100 ppm

Piridoxina-HCl B

100 ppm

Tiamina-HCl B

100 ppm

0.1

Glicina

100 ppm

10.000 ppm

100

m-Inositol
azcar

aa
Alcohol

0.5
0.5

MEZCLA DE SUSTANCIAS POCO


DEFINIDAS
Extracto de
levadura
Leche de coco
Extractos vegetales
Hidrolizado de casena
Peptona y triptona

Antioxidantes y Antibiticos

cido ascrbico o
vitamina C
cido ctrico
Carbn activado
Antibiticos

PREPARACIN DE UN LITRO DE
M.S.

C1 x V1 = C2 x
V2
C1: 82.5 g/L x 1000 mg =
82.500 mg/L
V1: ?
C2: 1650 mg/L
V2: 1000 ml
82.000 mg/L
V1 = 1650 mg/L x 1000
ml

PREPARACIN DE UN LITRO DE M.S.


SLIDO
Sacarosa
30 g ------------- 1000 ml
x
1000 ml
x = 30 g
Agar
8 g --------------- 1000 ml
x
1000 ml
x=8g

PREPARACIN DE UN LITRO DE M.S.


STOC
K
I

SALES
NH4NO3

ml/L
20

KNO3
II

MgSO4. 7H2O

10

MnSO4. H2O
ZnSO4. 7H2O
CuSO4. 5H2O
III

CaCl2. 2H2O

10

KI
CoCl2.6H2O
IV

KH2PO4
H3BO3
Na2MoO4.

10

PREPARACIN DE UN LITRO DE
M.S.

VITAMINAS

ml/L

cido Nicotnico : B

Piridoxina-HCl : B

Tiamina-HCl : B

Glicina:
m-Inositol:
azcar
Sacarosa:

aa

20
Aalcohol

Azcar

10
30 g

Agar

8g

pH

5.8

5. REGULADORES DE
CRECIMIENTO

Reguladores de crecimiento
Fitorreguladores
compuestos orgnicos
Producidos en la planta o sintticamente
actan en muy pequeas cantidades
Inhiben, promueven o modifican el
crecimiento y formacin de rganos
vegetales.
- Su accin es poco especfica, por lo que
se solapan los efectos de muchos de ellos
- Cuando son producidos por plantas :
fitohormonas
-

Fitohormonas:
- son fitorreguladores producidos por las
plantas
- actan en un lugar diferente de donde son
producidas
- Se clasifican de acuerdo a los efectos que
producen sobre el crecimiento o desarrollo
vegetal.
- Las cuatro principales familias son:
- auxinas - abscisinas
- giberilinas - otros
- citoquininas

Auxinas y citocininas
AUXINAS

SOLUBLE

IBA

cido indolbutrico

Alcohol

2,4-D

cido 2, 4-diclorofenoxiactico

Acetona y
ter

ANA

cido naftalenactico

Acetona y
ter

IAA

cido indol actico

Acetona y
ter

Dicamba

cido dicloro metoxibensico

Acetona y
ter

Picloram

cido tricloro piridinicarboxlico

Acetona y
ter

BAP

Bencilaminopurina

HCl y NaOH

KIN

Cinetina = (N-6
furfurilaminopurina)

HCl y NaOH

CITOKININA
S

Auxinas naturales

Auxinas sintticas

AUXINAS: IAA, IBA, NAA o 2,4-D


Mayor concentracin de auxinas en rganos jvenes
y en semillas inmaduras
IAA, se produce en forma natural en plantas [ ] 0,01 - 10mg/L.
Las auxinas sintticas y ms activas (IBA; NAA y 2,4-D) en [ ]
0,001-10 mg/L.
Las auxinas producen:
- elongacin celular
- expansin de los tejidos
- divisin celular (formacin de callo)
- formacin de races adventicias
- inhibicin de la formacin de vstagos axilares y adventicios
- embriognesis en los cultivos en suspensin

Acido 2,4-Diclorofenoxiactico: sinttico


- produce mutaciones (poco uso)
- inhibe fotosntesis (nicamente)
- pocas ocasiones estimula crecimiento de
plntulas
- en ocasiones estimula el crecimiento de las
plntulas recin germinadas
Acido -indolactico: se produce por
degradacin enzimtica de protenas,
proviene de degradacin de aminocido
triptfano.

Citocininas

Cotocininas

Accin de las citocininas

CITOQUININAS: (Kinetina, BA, 2iP y PBA)


Se utilizan para estimular el crecimiento y el
desarrollo.
- estimulan la divisin celular (en presencia de
auxina)
- en concentraciones elevadas (1-10 mg/L)
pueden inducir la formacin de vstagos
adventicios
- producen frutos sin semilla y sin polinizacin
- retrasan el envejecimiento de los rganos
vegetales.
- inhibe la formacin de races
- promueven la formacin de vstagos axilares,

Balances hormonales

BALANCES HORMONALES
CITOQUININAS

AUXINAS
(ALTO)

(BAJO)
RACES

EMBRIONES
CALLOS

YEMAS
ADVENTICIAS
(BAJO)

(ALTO)

Giberelinas

GIBERILINAS: (GA3)
Inicialmente aisladas del hongo giberella fujikuroi.
Luego se encontr que todas las plantas producen
esta fitohormona.
Presentes en semillas y tejidos en desarrollo
(meristemos, frutos jvenes).
- Inducen la elongacin de los entrenudos y el
crecimiento de los meristemos o yemas in vitro
- Puede romper la dormancia de embriones aislados o
yemas
- Inhiben la formacin de races y vstagos adventicios.
- AG3 es el ms usado, es muy sensible al calor (90.5
act. biol)

OTROS COMPUESTOS...

ACIDO ABSCSICO: ABA


- Produce efecto negativo en los cultivos in vitro
ETILENO:
- Influye en la embriognesis y formacin de rganos de las
gimnospermas.
- Algunas veces el crecimiento in vitro puede ser
estimulado por la
presencia de etileno.
Es altamente producido en condiciones muy hermticas,
en recipientes de plstico, en el flameo.
- POLIAMINAS
- FENILUREA
- AMINOCIDOS

OTROS COMPUESTOS...
Carbn activado:(CONC. 0,2 - 3 % P/V)
- Se produce por la carbonizacin de la madera
- Absorbe pigmentos txicos, marrones, negros, y en
cultivo de pltano
- Absorbe otros compuestos orgnicos (auxinas,
citokininas)
- El clima luminoso del cultivo cambia (se obscurece) y
forma races.
- Promueve la embriognesis somtica y la
embriognesis en cultivo de anteras
- Efecto estimulador del crecimiento y la organognesis
de las especies leosas.
- Estabiliza el pH
- Ayuda a evitar la oxidacin

ESTERILIZACIN

ESTERILIZACIN
El xito del cultivo de tejidos
depende de la capacidad de
mantener el medio libre de
microorganismos
Compiten por nutrientes con las clulas
vegetales
Crecen ms rpido e invaden el medio

Secretan sustancias txicas que matan


al explante

PRINCIPALES FUENTES DE
CONTAMINACIN
rea de trabajo
Instrumentos
Exterior de los recipientes
de cultivo
Material vegetal
Investigador

Esterilizacin
Desinfeccin de explantes
Esterilizacin de medios de cultivo y
soluciones
Esterilizacin de material de vidrio y
herramientas
Esterilizacin de papel, algodn, etc

Desinfeccin de explantes
Aconsejable iniciar con plantas
crecidas in vitro, por tanto libres de
contaminantes
De esto no ser posible:
Iniciar con material vegetal crecido en
ambientes controlados: invernadero o
laboratorio
Desinfectarlos antes de introducirlos in
vitro

Nunca:

Desinfeccin de explantes
Hipoclorito de calcio (9-10% por 5-30
minutos)
Hipoclorito de sodio (0.5 5% por 5-30
minutos)
Incluir en la solucin desinfectante
agentes humectantes (etanol 70:90%,
unas gotas de tween 20) u otros
detergentes tensin superficial
Agitacin o vaco mejora eficiencia
Enjaguar varias veces con agua estril

Desinfeccin de explantes
Si a pesar de la desinfeccin, luego
de varios das aparecen
contaminantes
Es probable que los microorganismos
estn en el interior del explante
Incluir fungistticos o
bacteriostticos en el medio de
cultivo
ej. sulfato de gentamincina, penicilina,
sulfato de estreptomicina, 10-50 mg /

Desinfeccin de explantes
El objetivo del proceso de desinfeccin es obtener
El mximo de esterilidad , y,
El mximo de sobrevivencia del tejido vegetal

Ensayar para determinar el mejor procedimiento a


seguir para cada tipo de explante
Recordar que los tejidos ms expuestos a las
soluciones desinfectantes son afectados en mayor
o menor medida dependiendo de la concentracin
de la solucin y del tiempo de exposicin
eliminar con el bistur estas zonas afectadas antes
de incluir los explantes en el medio de cultivo

ESTERILIZACIN DE
SOLUCIONES
AUTOCLAVEADO Calor hmedo vapor agua
Presin 15 psi o 2-2.2 atmsferas
Temperatura 121 C (mueren esporas)
Volumen mlTiempo min
25 20
50 25
100 28
250 31
500 35
1000 40

Sustancias sensibles al calor


Los azcares pueden caramelizarse
inhiben el crecimiento del explante
AG3 pierde 90% de actividad
pH se reduce
Vitaminas excepto piridoxina y
tiamina
Antibiticos
filtracin a travs de membranas
cuyo tamao de poro de 0.22 um

Control preventivo
de la contaminacin microbiana

Tejidos (explantes)
Fungistticos y bacteriostticos de amplio
espectro
Sulfato de gentamicina
Penicilina
Sulfato de estreptomicina
10 a 50 mg/L
35 a 40 oC

PLANTA

Esterilizacin = Asptico

Mtodos
Fsicos y qumicos
Axnico
Preparaciones libres de virus
viroides o micoplasmas

Preparacin del explante

NaOCl
1 % al 3 % germicida y agente
oxidante
Alcohol al 70 % durante 30 a 60
segundos
Bicloruro de mercurio HgCl2
0.1% a 1.5 % (p/v)
3 a 4 minutos

Procedimientos de esterilizacin

Calor seco (estufa)


170 oC durante 2-3 horas
Vapor bajo presin (autoclave)
manmetro
Calor hmedo a 100 oC
Filtracin

AUTOCLAVES

ESTU
FA

INCUBADORA