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REAES AG X AC

Aplicaes em Diagnstico e Pesquisa

Dra. Rosa Maria Tavares Haido


Profa. Associada Disciplina de Imunologia

Caractersticas das Reaes


Ag/Ac
Especificidade
Acs so formados sob influncia das caracatersticas

estruturais do Ag.
A sequncia de Aa do stio combinatrio tem a
configurao espacial mais adequada para complementar
a configurao espacial do eptopo

Caractersticas das Reaes


Ag/Ac

Especificidade
A capacidade

de um nico stio combinatrio do Ac


reagir com somente um eptopo.

Ligaes no covalentes
- Pontes de
Hidrognio
- Interaes
eletrostticas
- Foras de Van der
Waal
A capacidade de uma populao de molculas de Acs de reagir
- Interaes
somente com um Ag
hidrofbicas

Afinidade
Fora de reao entre um nico eptopo e um

nico stio combinatrio do Ac


Alta afinidade

Baixa afinidade

Ab

Ab

Ag

Ag

Afinidade
> ou < afinidade depende da
complementariedade entre Ag e Ac

> complementariedade reconhece grande


poro do eptopo
< complementariedade reconhece
pequena poro do eptopo e podem interagir
com molculas que tenham estruturas
semelhantes com < afinidade
REAO CRUZADA

Reao Cruzada
A capacidade de um nico stio combinatrio do Ac de
reagir com mais de um eptopo.
Ocorre entre Ags que compartilham os mesmos eptopos
ou possuem eptopos similares

Reaes cruzadas
Ac
Anti-A

Ac
Anti-A

Anti-A
Ac

Ag A

Ag B

Ag C

Eptopo igual

Eptopo similar

Avidez
A fora de ligao total entre um Ag com muitos eptopos e Acs
multivalentes

Keq =

104

106

1010

Afinidade

Avidez

Avidez

IgG - Ligao bivalente


- Afinidade alta (maturao de afinidade)

- Avidez alta

s para Ags solveis (eptopos acessveis)

IgM - Ligao pentavalente (stios de ligao

idnticos)

- Afinidade de cada stio para o Ag baixa


- Avidez total do Ac para Ag multivalente elevada

DIVERSIDAD
E

Acs especficos sintetizados


em resposta a um nico
eptopo so diferentes entre
si
e
tem
propriedades
diferentes, especialmente em
relao a afinidade

Interaes em propores mltiplas


Reversveis
Etapas das Reaes Ag x Ac

Combinao do Ag com o Ac

Manifestaes visveis dessa combinao


Expresso biolgica da reao Ag x Ac

Fatores Que Influenciam Nos Resultados Das


Reaes Imunolgicas
Antgenos
Anti-soros padronizados
Reaes padronizadas (tcnicas)
Avaliao: Sensibilidade, especificidade e valor preditivo

Fatores que influenciam a medio das


Reaes Ag/Ac
Afinidade
Avidez
Concentrao Ag:Ab
Estado fsico do Ag

Fatores que influenciam a medio das


Reaes Ag/Ac
Concentrao relativa de Ag e Ac

Excesso de Ac

Equivalncia
entre Ag e Ac

Formao de Rede

Excesso de Ag

Reaes Ag x Ac

Pesquisa
no Soro

nos
Tecidos

Ags ou Acs
Ags

Sorologia
Diagnstico de infeces
Deteco de Ags / Acs
Monitoramento do tratamento

Imunohistoqumi
ca

DETECO DE ANTGENOS E ANTICORPOS


Policlonais Monoclonais
ntegro

AG

Extrato
Purificado

AC

Peptdeo

Recombinante

Precipitao
Aglutinao

SISTEMA
REVELADOR

Fixao
do C`

Fluorocromo Radioistopo
Enzima

FONTES ANTIGNICAS

Antgenos totais
Antgenos de superfcie
Fraes purificadas
Protenas recombinantes
Peptdeos sintticos

Caractersticas Ideais de um Antgeno

Conter eptopos especficos

Ser comum as diferentes cepas


do patgeno

De fcil obteno e atravs de


metodologia reprodutvel

SOROLOGIA

Qualitativa

Quantitativa = Titulao
a dosagem semi-quantitativa do Ag /Ac usando Ac/Ag conhecido

TTULO
Titulao do
Ag

Titulao
de Ac

maior diluio do Ag ou Ac onde ainda h


manifestao visvel da reao
Determina a concentrao
mnima de Ag a ser usada numa
reao sorolgica
Determina a quantidade de Ac
presente em um soro =
SORODIAGNSTICO

PRINCPIO DA PRODUO DE ANTICORPOS

CARACTERSTICAS DOS ANTICORPOS


MONOCLONAIS

Homogeneidade
Especificidade
Reprodutibilidade

APLICAES DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS

Identificao de marcadores fenotpicos e


anlise funcional de molculas de superfcie
celular
Imunodiagnstico de doenas infecciosas
Diagnstico e terapia de tumores

SOROLOG
IA

PESQUISA DA CLASSE DE AC
Deteco de IgM Infeco primria
- Diagnstico de infeco em
recm-nascido
Deteco de IgM e IgG Infeco em curso
Deteo de IgG Convalescncia
- Vacinao
- Cicatriz sorolgica
- Teste de avidez para IgG

SOROLOGIA PAREADA
Coleta e anlise de duas amostras do
paciente
Segunda coleta 2-4 semanas aps a
primeira coleta

Converso sorolgica

Aumento de 4 vezes no ttulo de Acs do


soro da fase convalescente(2 coleta) em
relao ao soro da fase aguda(1 coleta)

SOROLOGIA
A escolha do teste sorolgico a ser utilizado no diagnstico de
infeces agudas deve levar em considerao a sensibilidade e
a durao do perodo necessrio para o aparecimento de
ttulos de anticorpos detectveis

Resultados positivos necessitam de testes confirmatrios

Resultados devem ser interpretados dentro de um contexto


clnico e epidemiolgico

Testes Sorolgicos Baseados nas Reaes


Ag/Ac
Todos os testes baseados nas reaes Ag/Ac
dependem da formao de rede ou utilizam recursos
(sistemas reveladores) para detectar pequenos
complexos imunes
Todos os testes baseados nas reaes Ag/Ac podem
ser usados para detectar ou Ag ou Ac

Testes de Formao de
Rede

Aglutinao
Antgeno = Partcula

Aglutinao/Hemaglutinao Direta

Direta
Ag
particulado

Agregado

Ac
solvel

Execuo da tcnica:
- tubo, lmina ou microplacas
- qualitativa ou quantitativa

Aglutinao/Hemaglutinao Direta

Direta Qualitativa

Tipagem
sangunea
Ac anti-Ag A
Hemcias A

A
O

AB

Aglutinao/Hemaglutinao Direta

Direta Qualitativa

Infeces Bacterianas
+

Sorotipagem de bactrias
Pesquisa de Acs para infeces (salmonelose,
leptospirose,toxoplasmose...)

Aglutinao/Hemaglutinao D
Direta quantitativa
0,5 mL

50 L do
soro

0,5 mL

0,950 mL
PBS

0,5 mL
PBS

1:20

1:40

0,5 mL

0,5 mL
PBS

1:80

0,5 mL

0,5 mL

0,5 mL

0,5 mL
PBS

0,5 mL
PBS

0,5 mL
PBS

1:160

1:320

1:640

Armazenar a 4C por 72 horas


Realizar a leitura a cada 24 horas

Acrescentar 0,5 mL de
Ag em cada tubo
Ex: REAO DE WIDAL - Febre tifide

Aglutinao/Hemaglutinao
Direta

Aglutinao Quantitativa

Ttulo

Prozona

Controle
Ag + tampo
salina
fosfato(PBS)

Aglutinao/Hemaglutina
o Direta

Prozon
a Falso
Negativos

Aglutinao/Hemaglutinao Direta

Aglutinao Quantitativa
Rede = Teste
positivo
Boto = Teste
negativo

Ttulo
1:256

1:512

Aglutinao/Hemaglutinao Direta

Ex: Tipagem de grupos


sanguineos
Sorotipagem de bactrias
Reao de Widal (febre
tifide)

1/512

1/256

1/64
1/128

1/32

1/16

1/8

1/4

Consideraes Prticas
Fcilidade de execuo
Baixo custo
Elevada sensibilidade
Leitura visual
Semi-quantitativo
1/2

Aglutinao /Hemaglutinao Indireta


Definio

Antigeno solvel adsorvido a superfcie de uma particula


(ltex, hemcia)

Aplicaes

Ex: TPHA Hemcias de Carneiro sensibilizadas com Ag


deTreponema pallidum

Sorodiagnstico de sfilis
(VDRL latex)

(VDRL- floculao)

Resultado negativo
(microscpio ptico x 100)

Resultado positivo
(microscpio ptico x 100)

Testes de Coombs (Antiglobulina)


Teste Coombs Direto
Detecta anticorpos nos eritrcitos do cordo umbilical

+
Eritrcitos do Paciente

Reagente de Coombs

(Anti-imunoglobulina)

Teste de Coombs (Antiglobulina)


Teste de Coombs Indireto
Detecta anticorpos anti-eritrcitos no soro da me
Etapa 1

+
Soro do paciente

Eritrcito teste

Etapa 2

Reagente de Coombs

(Antiglobulina)

Testes de Coombs (Antiglobulina)


Aplicaes
Deteco de Ac anti-Rh
Anemia hemoltica autoimune

Inibio da Aglutinao/Hemaglutinao
Definio - Teste baseado na inibio da aglutinao
devido a competio com um Ag solvel
Controle Positivo (Sem amostra do
paciente)

Deteco / medida de Ag solveis


Teste positivo = Ausncia de Aglutinao

Inibio da Aglutinao/Hemaglutinao
Definio - teste baseado na inibio da aglutinao devido
a presena de Ac no soro de paciente
Controle positivo (Sem amostra do paciente)
Hemaglutini
na viral

YY

Y
(Ac ?)

Deteco / medida de Ac
Teste positivo = ausncia de aglutinao

Y
Ex: diagntico de vrus
hemaglutinantes
(Influenza)

Inibio da Aglutinao/Hemaglutinao

Inibio da Aglutinao/Hemaglutinao
Aplicaes
- Medio de Ags solveis
- Diagnstico de viroses por vrus
hemaglutinantes ( Influenza)
- Teste de Gravidez
Consideraes prticas
Mesmas dos testes de aglutinao

Rede = Teste
negativo
Boto = Teste
positivo

Testes de Formao de Rede

Testes de
Precipitao
Ag Solvel

Precipita
o
Definio - Testes que tm como resultado final a precipitao

de um Ag solvel

AG solvel + AC solvel

Complexo Insolvel
(rede tridimensional)

A formao de complexo insolvel


depende de:

relativa do Ag e Ac (excesso de um ou outro

forma complexos solveis)


N de eptopos presentes na molculas

Precipitao em
meio Lquido
Em tubos

Precipitao em meio Gelificado


Imunodifuso Radial Simples (Mancini)

Mtodo
Ac incorporado ao gel
Ag no poo

Interpretao

Dimetro do anel
proporcional a concentrao

Quantitativo
Nveis de Igs

Imunodifuso Radial Simples (Mancini)

Imunodifuso Radial Dupla (Ouchterlony)

Mtodo
Ag e Ac colocados em poos equidistantes no gel
Permite comparao simultnea de vrios sistemas antignicos

Interpretao
Nmero de linhas de precipitao = quantidade de eptopo

Ex: diagnstico de micoses, titulao de soros

Imunodifuso
Radial Dupla
(Ouchterlony)
Comparao entre
fraes antignicas
A- Identidade
B- No identidade
C- Identidade parcial

Contra-imuno - Eletroforese
Mtodo

Ag e Ac migram um contra o outro por eletroforese


Usado somente quando Ag e Ac tem cargas opostas
O movimento eletrofortico e a eletroendosmose concentram
rapidamente Ag e Ac

-+

+
Ag

Ac

Contra-imuno - Eletroforese
Qualitativo
Semiquantitativo
Mais sensvel que a imunodifuso dupla
Rpido
Uso: deteco rpida de Ags bacterianos
(pneumonia, meningite, septicemia)

Imunoeletroforese
Mtodo
Ags so separados por eletroforese
Ac colocado em um recorte no agar

Ag

Ag
Ab

Ag
Ab

Interpretao
Arcos de precipitao representam o nmero de antigenos

Imunoelectroforese
Qualitativo
Concentrao relativa

Aplicao:
Caracterizao de protenas anormalidades
estruturais ou alteraes nas concentraes

Mtodos Automatizados

Nefelometria

- Precipitao entre Ag x Ac em solues dliluidas


produzem aumento da reflexo da luz que medida
pela disperso da luz incidente
- Acs especficos purose m concentraes constantes
- Concentraes crescentes da amostra em anlise
- Intensidade da luz dispersada = densidade tica
-Vantagens:
Totalmente automatizado, fcil realizao, rpido e preciso
-Desvantagem:
Custo elevado dos equipamentos e dos soros imunes
Reaes inespecficas: soros lipmicos e hemolisados
Vrias diluies =Ags concentrados
- Aplicao:
Determinao de proteinas de significado clnico em
qualquer fluido corporal
Ex: Fator reumatide, IgA, IgG, IgM, C3, C4,albumina,
Ptn C-reativa, transferrina, fibronectina, etc....

Mtodos Automatizados
Turbidimetria
Mtodo

sujeito as mesmas condies da


Nefelometrias
Principal diferena: sinal de deteco a
absorbncia
Vantagens:
-No necessita de equipamentos especiais
- Reaes podem ser medidas em
espectrofotmetro
Aplicaes:
- As mesmas da nefelometria