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Faculdade de Medicina
Fisiologia Humana
Ramatis de Oliveira
https://maps.google.com/maps?hl=pt-PT&safe=off&q=estao%20biolgica%20roscoff&um=1&biw=1600&bih=732&ie=UTF-8&sa=N&tab=il
http://pos-darwinista.blogspot.com.br/2010/06/genoma-de-alga-marrom-revela-como-vida.html
Ectocarpus siliculosus
Aqui crescendo em Zostera, alga marinha de que se extrai soda, ocorre
principalmente ao longo da costa em latitudes temperadas. (Crdito: Foto
por Akira Peters, Estao Biolgica Roscoff)
http://www.natuurlijkmooi.net/schotland/wieren/delesseria_sanguinea.htm
Delesseria sanguinea
Comum em rochas de regies de piscinas profundas e escuras.
http://bioinformatics.psb.ugent.be/genomes/view/Zostera-marina
Zostera Marina
Encontrada em substratos arenosos ou em esturios ou parcialmente
submersas flutuantes.
http://www.johnsbooks.org/photo/photography1.htm
Porphyra umbilicalis
Encontrada em diversas regies costeiras pelo mundo.
http://www.aphotomarine.com/red_seaweed_gracilaria_gracilis.html
Gracilaria gracilis
Encontradas em regies intertidais.
http://waste.ideal.es/gelidiumspinosum.htm
Gelidium spinosum
Encontrada em rochas e lagoas costeiras.
http://toonrzrz.wordpress.com/page/2/
Chondrus crispus
Mar rtico.
http://www.marlin.ac.uk/speciesinformation.php?speciesID=3995
Laurencia pinnatifida
Costas rochosas da Gr-Bretanha e Irlanda.
Procedimentos
http://www.portais.ws/?page=art_det&ida=29505
Procedimentos
Procedimentos
Para os testes de atividade enzimtica foram
utilizados 50g de algas em p;
Foram ressuspensas em 1mL de gua destilada.
Extraiu-se a suspenso aps 1h a 98C.
A suspenso foi centrifugada por 5min a 3.000 g e
Transferida para um novo tubo.
O processo foi feito em 3 parcelas de cada alga e os
produtos ps-centrifugao foram misturados.
Procedimentos
A massa seca foi recuperada de cada extrato, para
calcular a atividade enzimtica e para gravar os
espectros e 1H-RMN*.
*Prton de RMN (ou hidrognio-1RMN ou 1H-NMR), a aplicao de
ressonncia magntica nuclear, em espectroscopia, em relao ao hidrognio
dentro dos ncleos de molculas de uma substncia, a fim de determinar a
estrutura das suas molculas. Nas amostras em que o hidrognio utilizado,
praticamente todo o hidrognio constitudo pelo istopo 1H (hidrognio-1,
ou seja, tendo um prton por ncleo).
Procedimentos
Cem microlitros de extrato de algas foram incubados com, 1
mg de enzima a 30C em 300 mM de NaCl e 10 mM acetato de
sdio, 16 mM de citrato trissdico (pH 7,2) at que a digesto
completa pudesse ser obtida.
Digesto completa foi monitorizada com adio de enzima e
remedio da quantidade de oligossacardeos liberados. As
amostras foram centrifugadas durante 30 minutos a 3.000 g,
para girar para baixo as partculas de gel no-digeridos, e
reequilibrados durante 20 minutos a 20C.
Produtos de reao solveis no sobrenadante foram
quantificados por um redutor de acar.
A quantidade de reduo so apresentados em glicose
equivalentes.
Procedimentos
Clonagem da Zobellia galactanivorans;
Duas enzimas (Zg2600 e Zg3628) ;
foram amplificadas por PCR* e subsequentemente
clonadas.
Todos os alvos foram tratados com PCR
temperatura de 70C.
*Reao de Polimerizao em Cadeia (tcnica de replicao sequencial de
DNA in vitro).
Procedimentos
Os produtos foram digeridos com uma mistura de restrio
correspondente enzima/sistema amortecedor durante 3 horas a 37C.
Aps a digesto, os produtos de PCR foram novamente purificados
com um kit de purificao de DNA padro e, finalmente, eluiu-se
com 25 L de H2O.
Ligados com plasmdeo* pET15b-derivado, desfosforilado.
Para transformao quimicamente compoetente de clulas DH5 E.
coli foram utilizadas seguindo padres.
* Os plasmdeos ou plasmdios so molculas circulares duplas de DNA capazes
de se reproduzir independentemente do DNA cromossmico. Ocorrem geralmente
em bactrias e por vezes tambm em organismos eucariticos unicelulares.
Procedimentos
Os clones obtidos foram transformados em clulas
BL21 recombinante e, depois, inoculado 3 ml de
Luria-Bertani, caldo pr-cultura, suplementado com
100 gml-1 de ampicilina*.
A pr-cultura foi incubada durante a noite a 37C e
foram transferidos 10 L (de ampicilina) para
inoculao de 2 mL de ZYP-5052 (indutor de
expresso de protenas).
* Antibitico da famlia da penicilina (-lactmico).
Procedimentos
As culturas foram incubadas a 20C por trs dias e
colhidas por centrifugao.
As clulas foram lisadas com 500 ml de tampo de
lise (composta por 50 mM Tris*, pH 8, 300 mM
NaCl).
O lisado celular foi centrifugado e o sobrenadante foi
separado por purificao por afinidade em lotes com
resina de nquel hypercel.
* Composto orgnico utilizado como soluo tampo.
Procedimentos
O remanescente foi extrado com 6 M de ureia durante 30 minutos e centrifugouse. O
sobrenadante foi armazenado durante a eletroforese*.
Procedimentos
As protenas ligadas foram eludas por adio de 500 mM de soluo
imidazol*.
Cristalizao: PorA foi cristalizado pelo mtodo de gota suspensa em
18-20% de PEG 4000**, 0,2 M de sulfato de amnio e 0,1 M acetato
de sdio, pH 4,6, a 20C.
Gotas continham 2 mL de 2,6 mg ml -1 soluo de protena mais 1 ml
de soluo de cristalizao e foram equilibradas contra 500ml
soluo de cristalizao.
* Substncia alcaloide.
** Os Polietilenoglicis so polmeros de baixo peso molecular obtidos a partir da
reao de polimerizao do xido de Etileno em presena de um iniciador (Etileno
Glicol, lcool ou gua) e tambm um catalisador.
Procedimentos
Cristaizao: PorB a 33-35% de PEG 1000, 0,4 M
de ltio sulfato e de 0,1 M de tampo MES a pH 6,0.
As gotas de estar foram formados por 2 ml de mistura
de soluo de protena (5,6 mg ml -1) E 1 ml de uma
soluo de cristalizao, e equilibrou-se contra uma
soluo de cristalizao de 500 ml de 20C.
Por crioconservao, os cristais foram levados a
glicerol a 10% em incrementos de 5% na soluo de
cristalizao.
Procedimentos
Purificao dos oligossacardeos;
As amostras de oligossacardeos foram analisadas
com ressonncia magntica nuclear;
Sequenciamento e anlise filogentica.
O Caso
Pesquisadores descobriram uma nova classe de
enzimas (CAZimas) que degradam polissacardeos
sulfatados estudando a bactria marinha Zobellia
galactanivorans.
O Caso
O Caso
Entretanto, o problema do consumo de algas a
digesto desses carboidratos, devido presena de
grupos sulfatos.
A Descoberta
A Descoberta
Os pesquisadores resolveram ento procurar em bases
de dados outras bactrias que degradassem estes
carboidratos.
E eles encontraram mais 6 bactrias.
Curiosamente, uma no era bactria marinha como
a Z. galactanivorans, mas uma espcie encontrada na
microbiota de seres humanos mais especificamente,
de japoneses!
A Bacteroides plebeius.
Testes em humanos
O genoma do intestino de 13 japoneses e 18 norte
americanos foi analisado. Sendo que nenhum norte
americano apresentou a enzima, e 7 japoneses sim.
Concluso
Levando em conta que tais enzimas esto ausentes no
meio terrestre, presume-se que a aquisio de
bactrias que digerem polissacardeos de algas
relativamente recente dentre os humanos.
Alm disso, a alga Nori a nica fonte possvel de
polissacardeos digeridos por estas enzimas. Ou seja,
provavelmente estas bactrias devem ter sido
adquiridas pelos japoneses atravs do consumo desta
alga.
Concluso
H tempos fala-se na possibilidade de a microbiota
intestinal trocar genes com microrganismos do
ambiente. Mas isso era apenas uma hiptese provvel,
mas nunca demonstrada at este artigo.
Essa transferncia importante para a evoluo, uma
vez que permite o aproveitamento de nutrientes que
anteriormente no teriam valor para humanos.
Reflexes
Ento, voc, ocidental, que gosta de comer sushi e
outros pratos base de algas, fique sabendo: voc
NO digere os polissacardeos destas algas.
Aps observar a metodologia utilizada, ficam am
perguntas: Com tantas etapas artificiais, com tantas
intervenes qumicas e fsicas, qual a utilidade
dos resultados obtidos? No que isso tudo que foi
feito se assemelha ao que ocorre in natura? A
respostas seria visualizar indcios?