MTODOS DE ESTUDIO DE

LA CLULA

Biologa Celular y Molecular

UPSJB

MTODOS UTILIZADOS PARA EL ANLISIS

INSTRUMENTAL DE LA ESTRUCTURAS
BIOLOGICAS

- MICROSCOPIA
- FIJACIN Y COLORACIN
- MTODOS CITOQUIMICOS
- CULTIVO CELULAR
- FRACCIONAMIENTO CELULAR.

Cardiomiocito mus
estriado , citopatologia

Clula cancerosa del pulmn

glbulos rojos con leucocito

OVOCITO HUMANO

10 m

-4
100 Micrmetros =
1 diez milsima de metro

10 m

-5
10 Micrmetros =
1 cien milsima de metro

TOMO DE HIDRGENO

VIRUS

1OO Nanmetros =

UN GLBULO ROJO

10-7 m

1 diez millonsima de metro

10 m

-10
1 Angstrom =
1 billonsima de metro

La microscopa es la tcnica de producir imgenes visibles

de estructuras o detalles demasiado pequeos para ser
percibidos a simple vista.
la microscopa generalmente implica la difraccin, reflexin
o refraccin de radiacin incidente en el sujeto de estudio.

 pticos o luminosos
- Campo Claro:

de ondas luminosas, luz

visible, luz natural :

- Campo oscuro o Ultramicroscopa.

Luz

dispersada a nivel de interfases. Lentes de

condensador estn modificadas. El objeto brillante
fondo oscuro

- Contraste de fases e Interferencia :

en

se
producen retrasos en las radiaciones que atraviesan el objeto y
aparece en tonos de gris que dependen del
producto entre el
espesor del objeto y las
diferencias
entre los ndices de
refraccin del

objeto y del medio

clulas vivientes/tejidos . M. Interferencia

notable del relieve en la estructura de la clula viviente
.

efecto

Microscopio
Contraste de
FAses

-Fluorescencia Descubierto en 1908 por Khler y

Siedentopf, y se basa en que una sustancia natural en las clulas o
un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz
de luz, emitiendo parte de la energa absorbida como rayos
luminosos Se utiliza para detectar protenas u otras molculas
especficas en una clula.
La utilizacin en el quirfano de un microscopio dotado de mdulo de
luz fluorescente consigue la extirpacin total de los tumores
cerebrales malignos en un 67% de los casos, segn los datos
obtenidos de un estudio publicado en la revista cientfica americana
The Lancet Oncology
Microscopa de fluorescencia. Se observa una
micrografa de una clula en mitosis. Para obtener esta
imagen, se emplearon tres molculas fluorescentes
distintas con el fin de teir tres componentes celulares
diferentes. Se us un anticuerpo acoplado a una
protena fluorescente verde para detectar a los
microtbulos, otro anticuerpo acoplado a una protena
fluorescente roja para detectar a los centrmeros, y un
colorante fluorescente azul para teir el ADN, que se
encuentra condensado formando los cromosomas.

- M. Campo oscuro

- M. Fluorescencia

Tinciones Coloracines
Son tcnicas que permiten observar microorganismos en
funcin de la capacidad de los mismos para retener (o
no) determinadas sustancias colorantes, lo que depende
de la carga de la clula y del colorante.
a) Organismos clulas vivas:
- Tincin vital ( colorantes incuos)
-Tincin supravital: adicin de colorante a clulas

extirpadas de organismos (rojo neutro, verde de janus,

azul de metileno)
b)Tejidos Muertos , Biopsias
-Tinciones no vitales

Obtencin, Fijacin, Inclusin, Cortes, Tincin Montaje

Tipo de Colorantes
1.- Catinicos. Son sustancias que tienen carga
positiva. Penetran en el interior de las clulas y las
tien. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta,
Safranina, Hematoxilina , Hematoxilina frrica;
derivados de la anilina (metacromatica) Azul de
toluidina, azul de metileno, rojo neutro, verde de janus.
2. - Aninicos. Con carga negativa. No penetran en
el interior celular, de modo que no tien las clulas, sino
el entorno. En este caso se habla de tincin negativa.
Ejemplos: Eosina, Nigrosina,cido pcrico (cromo tropo)
diazoico (azul de tripana, rojo de tripano
3- Liposolubles. Se mezclan con los lpidos celulares
y los tien (Negro sudn)
Por otro lado las tinciones pueden realizarse siguiendo
distintos mtodos.

TIPO DE COLORACIONES
- Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho
de que las clulas tienen una composicin qumica diferente
a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de
forma diferente frente a un colorante. El colorante tie las
clulas (Azul de metileno, Safranina) o no (Nigrosina) .
- Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos
de clulas tienen distinta composicin qumica, y por lo
tanto reaccionan de forma diferente frente a una tincin, lo
que permite clasificar los microorganismos en diferentes
grupos, segn su capacidad de tincin. En este apartado
estn dos tinciones de importancia taxonmica y mdica: la
tincin de Gram y la de cido-alcohol resistencia (de ZiehlNielsen). Estas tinciones utilizan ms de un colorante
- Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas
estructuras celulares tienen distinta composicin qumica,
de modo que se tien selectivamente con ciertos colorantes.
Ej; tincin de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de
corpsculos metacromticos. Pueden utilizarse uno o ms
colorantes

Microscopia Electrnica
Permite la observacin de ultraestructura.
Los electrones emitidos dentro de un tubo al vaci son
acelerados y luego desviados a campos magnticos que
actan como lentes pticas . La imagen se visualiza sobre
una pantalla fluorescente y es producida por la
dispersin de los electrones al chocar con los ncleos
atmicos presentes en el objeto. La dispersin depende
del espesor del objeto de la concentracin de los tomos
y del nmero atmico. Se usan tomos pesados que
actan como colorante electrnicos y aumentan el
contraste.
Poder resolutivo 0,3 a 0,5 nm y aumento millon de veces
a ms.
Las macromolculas ADN-ARN se puede estudiar por
medio de la tcnica de monocapa. Caso de estructura de
membrana se estudia mediante la tcnica congelacin
fractura seguida o no de gravado

Microscopio Electrnico

Transmisin

Barrido

Micrografa Lser Confocal de una

muestra de fango de aguas residuales

Mucosa in delg

Feto de seis
dias

BARRIDO ( Scanning) permite obtener una vista de

superficie del objeto utilizando los electrones secundarios
emitidos ya que los electrones se reflejan en la superficie
de la muestra y la imagen revela la morfologa superficial.
TRASMISION (STEM) se utiliza un fino haz de electrones
para efectuar el barrido del corte (seccin fina del
muestra y revela la estructura interna ); los electrones
dispersados son analizados con detectores especiales . Se
obtiene imgenes de macromolculas sin colorear.

HIV Lt CD4 Microscopa

barrido

Clulas de Lactobacillus
adheridas al epitelio gstrico de
un ratn

Preparacin de las muestras

El proceso comienza con el tejido altamente
hidratado y termina con el tejido virtualmente libre de
agua y preservado en una matriz de resina.
Existen muchos caminos para la preparacin de
tejidos para Microcopia electrnica de transmisin,
pero los mtodos siguen bsicamente ocho pasos:
1. Fijacin primaria: Busca preservar la estructura del
tejido vivo, evitando los procesos autoliticos. Se
realiza con glutaraldehido y su accin se centra en las
protenas. La penetracin del glutaraldehido es
lenta, esto quiere decir que 1 mm de tejido es
atravesado en una hora por el glutaraldehido.

Preparacin de las muestras

El proceso comienza con el tejido altamente
hidratado y termina con el tejido virtualmente libre de
agua y preservado en una matriz de resina.
Existen muchos caminos para la preparacin de
tejidos para Microcopia electrnica de transmisin,
pero los mtodos siguen bsicamente ocho pasos:
1. Fijacin primaria: Busca preservar la estructura del
tejido vivo, evitando los procesos autoliticos. Se
realiza con glutaraldehido CHO- CH2-CH2-CH2-CHO. Su
accin se centra en las protenas as:
(COOH-protena-NH2)2 + CHO- CH2-CH2-CH2-CHO
Entonces:
COOH-protena-NH=CH-CH2-CH2-CH2-CH=N-proteinaCOOH +H2O
La penetracin del glutaraldehido es lenta, esto
quiere decir que 1 mm de tejido es atravesado en una
hora por el glutaraldehido.

2. Tampones: liquido fijador que reproduzca en la mayor

medida posible las condicones medioambientales del
tejido vivo en lo que respecta al pH
3. Fijacin secundaria: es llevada a cabo por la accin del
tetrxido de osmio, el cual reacciona principalmente con
los lpidos. El tetrxido de osmio generalmente no
penetra mas de 0,5 mm en una hora.
4. Deshidratacin: La filosofa de la deshidratacin es el
reemplazo del agua usando etanol en series 70% 85%
95% y etanol absoluto.
5. Infiltracin con solventes transicionales: procedimiento
por el cual hay transmisin de fluidos gradualmente
reemplazado por soluciones intermediarias altamente
miscibles con los agentes deshidratantes, la mayora de
los protocolos emplean un solvente transicional entre el
deshidratante y la resina.

6. Infiltracin con resina: mezclas de propilen oxidado

con Epoxy son introducidas reemplazando dentro de los
tejidos despus de la deshidratacin. La concentracin
del solvente es minimizada gradualmente
incrementando las concentraciones de resina hasta
llegar a la resina pura.
7. Inclusin: sumergir el tejido en la resina pura.
8. Polimerizacin de la resina: se logra acelerar el
proceso de polimerizacin aumentando la temperatura.
Resolucin y magnificacin La tcnica de preparacin de las
muestras cumple con protocolos establecidos, pero son
vulnerables y variados al tipo de investigacin

HERRAMIENTAS DE LA NANOTECNOLOGIA
Los microscopios ven cosas a travs de lo que sienten con una punta
muy afilada que est puesta en algo que parece un alfiler.

METODOS CITOQUIMICOS
Citoqumica: identificacin y localizacin de los
componentes qumicos de la clula a) separacin de
fracciones celulares y su anlisis por tcnicas
bioqumicas b) aislamiento de tejidos y aun de clulas
para su anlisis con micro y ultramtodos c) mtodos
de coloracin citoqumica d) mtodos basados en
parmetro fsicos.
Protenas: reaccin Millon
Aldehdos: reaccin Schiff es la leucobase de la
fucsina bsica decolorada
ADN: reaccin Fulgen despus de una dbil hidrlisis
cida que elimina ARN y evidencia a aldehdos unidos
a las bases pricas tie al ncleo de color morado
Polisacridos: reaccin de PAS, por oxidacin de
grupos 1,2 glicoles por el cido perydico.
Enzimas: a partir de cortes congelados incubados con
sustratos especficos y el producto se convierte en un
precipitado o un compuesto coloreado.

CULTIVOS CELULARES
Principal mtodo para estudiar a la clula viviente
Burrows (1910) uso plasma de pollo para nutrir
explantes de tejidos embrionarios de pollo. Este medio
revel ser mucho mejor que los anteriormente probados,
permitiendo observar crecimiento de tejido nervioso,
corazn y piel.
Burrows y Carrel (1912) realizaron los primeros
intentos de establecer cultivos de clulas de mamfero,
consiguiendo mantener explantes obtenidos a partir de
perros, gatos y conejos de indias

 R.G. Harrison (1907), padre de los cultivos de tejidos

animales, fue el primero en emplear tcnicas in vitro para el
estudio de fenmenos in vivo, realizando cultivos de mdula
espinal de anfibios. Observo el crecimiento de axones de
neuroblastos en una gota de linfa de Rana que colgaba de un
cubreobjetos en una cmara sellada.
Rous y Jones (1916) emplearon por primera vez extractos de
tripsina para disociar clulas de embriones de pollo,
estableciendo el primer cultivo celular.

 Sanford, Earle y Likely (1948) aislaron la lnea celular L

mostrando que eran capaces de formar clones en el cultivo
de tejidos..
Grey, Coffman y Kubicek (1952) establecen la primera lnea
celular contina, las actualmente bien conocidas clulas
HeLa obtenidas de carcinoma humano, L y 3T3 de embrin
de ratn
Hayflick y Moorhead (1961) usaron por primera vez
antibiticos para prevenir la contaminacin de los cultivos de
fibroblastos, pudiendo mantenerlos durante 12 meses.
Augusti-Tocco y Sato (1969) establecen la primera lnea
celular estable de neuroblastoma aislando clones que
establecan procesos nerviosos y que eran elctricamente
excitables.
Kohler y Milstein (1975) establecen la primera lnea celular
productora de anticuerpos monoclonales.

Aplicaciones del cultivo celular.

Actividad intracelular. Mecanismos implicados en los diferentes

procesos intracelulares, como transcripcin de DNA, sntesis de
protenas, metabolismo energtico.
Flujo intracelular. Movimientos de sustancias y seales asociadas a los
diferentes procesos fisiolgicos, como ensamblaje y desensamblaje
de componentes intracelulares, movimientos del RNA : ncleocitoplasma, movimiento de protenas.
Ecologa celular. Estudio de las condiciones ambientales responsables
del mantenimiento de la funcionalidad celular, de su diferenciacin,
cintica de la poblacin celular.
Interacciones celulares. Procesos de induccin embrionaria,
cooperacin metablica, inhibicin por contacto o por adhesin,
interacciones clula-clula.

 CULTIVOS EN SUSPENSION

Algunas clulas requieren de un medio fluido

para poder desarrollarse e interaccionar, estos
sistemas en suspensin tambin contiene
macromolculas que sirven de matriz
protegiendo e interaccionando con la superficie
celular; stas se encuentran en el suero y
proporcionan un sistema balanceado de
nutrientes.
Este tipo de cultivo es ideal cuando se quiere
estudiar fenmenos intracelulares o cuando se
presentan problemas con la capacidad de
anclaje de un determinado tipo de clula.

Cultivo de clulas en suspension

 CULTIVOS PRIMARIOS

Se obtienen a partir de muestras de tejido que son

tomadas directamente a partir de organismos vivos,
los cuales son tratados mediante enzimas
proteolticas a fin de disgregar las clulas
inmediatamente son cultivadas en un medio
apropiado por periodos cortos de tiempo dentro de
los cuales se da el anlisis.
CULTIVOS SECUNDARIOS
Derivan de un cultivo primario

 LINEAS CELULARES
Estos son cultivos que se establecen a partir de la
seleccin de un clon especifico proveniente de un
cultivo primario tripsinado. De uso mas corriente
son las lneas establecidas las cuales se han
adaptado a un crecimiento prolongado in vitro por
transformacin cancerosa. Estas clulas son
escogidas de acuerdo a caractersticas deseadas y
son mantenidas por un numero indeterminado de
generaciones e inclusive se les suele almacenar a
temperaturas de nitrgeno liquido
Una de las primeras lneas celulares humanas,
obtenida de Henrietta Lacks, quien falleci de cancer
de tero a partir de cul se obtuvieron estas clulas. El cultivo de clulas HELA que
se muestra en la imagen fue teido con Hoescht que se une al ADN coloreando de
azul el nucleo

CONDICIONES PARA EL CULTIVO CELULAR

(MICROAMBIENTE)

Medio de cultivo. Debe contener los nutrientes bsicos para la

supervivencia de las clulas como y estimuladores (hormonas) que
promuevan su diferenciacin y viabilidad.

Gases (O2 y CO2) y pH. Debe garantizarse un 20% de O2

(atmosfricos) y un 5% de CO2 (tisular) en el sistema los cuales
deben ser administrados con una adecuado sistema de ventilacin
y filtros que garanticen la eliminacin de contaminantes.
Osmolaridad-humedad. Debe garantizarse una ambiente hmedo,
que evite la evaporacin del agua del medio de cultivo lo que
incrementar lo osmolaridad del mismo.

Temperatura. El estricto control de la temperatura es muy

importante al tratarse de un factor crtico en la mayora de los
experimentos con clulas de mamferos cuyo metabolismo ptimo
es a 37 . Cuando en un experimento aparecen problemas y datos
no explicables, la causa suele ser un deficiente ajuste de la
temperatura.

Medio de Cultivo

Equipos para cultivo

celular A) Cmara de flujo
laminar B) Incubadora de
CO2 C) Microscopio
C

FRACCIONAMIENTO CELULAR

El fraccionamiento celular es un conjunto de

mtodos y tcnicas que tienen por objetivo
obtener fracciones puras o enriquecidas de
un determinado componente celular, ya sea
ste un orgnulo (mitocondrias, ncleos,
peroxisomas, etc.) una fraccin de
membrana (membrana total, plasmtica,
dominio basolateral, etc. complejos)
multiproteicos (citoesqueleto, poros
nucleares, etc), etc.

Etapas del fraccionamiento clular

Todo proceso de fraccionamiento subcelular tiene
dos etapas :
Rotura de clulas o tejidos para obtener un
lisado celular (o tisular) en el que la fraccin
deseada se encuentre en condiciones adecuadas
para su purificacin.
Separacin de la fraccin deseada mediante
algn criterio como diferencia de densidad
(centrifugacin en gradientes o diferencial),
presencia de antgenos (cromatografa de
inmunoafinidad, inmunoprecipitacin, etc.), etc.

Rotura de clulas o tejidos

Se consigue usando procedimientos mecnicos suaves conocidos como

homogenizacin. Estos producen la rotura de las membranas celulares,
suavemente, liberando el contenido celular.

Los procedimientos de homogenizacin ms comunes son :

Sonicacin en la cual se aplica ultrasonidos a la suspensin celular,

producindose una intensa agitacin que destruye las membranas.
Dependiendo de la frecuencia, intensidad y energa se puede destruir
estructuras subcelulares e incluso complejos proteicos.

Detergentes no ionicos que solubilizan la membrana celular.

Homogenizadores. Los que rompen las clulas con la ayuda de un mbolo

rotatorio que se ajusta perfectamente a las paredes de un tubo de cristal
especial, el homogenizador.

Sonicador

Separacin de las fracciones

deseadas
Centrifugacin
Se basa en hacer girar un tubo a gran velocidad, con la ayuda de
un rotor (centrifugacin), de forma que se genera una fuerza
centrifuga que produce la precipitacin de partculas en el fondo,
ya que estas tienden a hundirse hasta alcanzar una densidad igual
a la del medio en que se encuentran.

Centrifugas
Son instrumentos que generan intensas fuerzas centrifugas al girar
las muestra ha altas velocidades produciendo sedimentacin. De
acuerdo a la aceleracin que alcanzan se las denomina como
centrfugas (de pocas g a 3000 g), supercentrfugas (de 2000 xg a
20000 xg) y ultracentrfugas (de 15000 xg a 600000xg), en estas
ltimas se suele controlar la temperatura mediante refrigeracin,
adems es necesario generar vaci para evitar la sobrecalentamiento
debido a la friccin.

Tipos de centrifugacin
Centrifugacin diferencial
Se basa en la diferencia de densidad entre las
partculas en suspensin y el medio que las
contiene, de modo que al aplicar un campo
centrifugo estas precipiten. Una muestra en la que
existen varios tipos de partculas, puede separarse
por centrifugaciones sucesivas ya que las partculas
mayores y/o ms densas precipitaran primero y
cuando el sobrenadante de esta primera etapa es
recentrifugado en condiciones de ms tiempo y
aceleracin sedimentaran las nuevas partculas
ms densas presentes, y as sucesivamente.
obtenindose sedimentos o fracciones de partculas
de diferente tamao y/o densidad.

Centrifugacin en gradiente de
densidad continua
Esta tcnica se basa en la diferencia de
densidad boyante (o de flotacin) que existe
entre diferentes componentes de una muestra a
analizar. Para esto se prepara una gradiente de
densidad (generalmente de sucrosa o de cloruro
de cesio), de modo que los componentes de la
muestra se separaran migrando hasta aquellas
en zonas en las cuales su densidad iguale a la
del medio, es decir, a la de la gradiente. Para
esto se usa agentes disolventes como el DMSO.

Centrifugacin en gradiente de
densidad discreta
En esta tcnica tambin aprovecha la diferencia
de densidad boyante de los componentes de la
muestra. Ac se generan 2 zonas de diferente
densidad (2 concentraciones de sucrosa o de
cloruro de cesio) de tal forma que la muestra se
separara en tres grupos bien definidos, el primer
grupo que se ubicara en la zona de densidad
baja, un segundo grupo en la de densidad alta y
el tercer grupo que se ubicara en la interfase ya
que su densidad es intermedia entre las 2
aplicadas.