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Prof.

: Cynthia Canedo da Silva


Aula 8: Micro-organismos e
Engenharia Gentica

Bibliografia: Tortora et al., 2012 - Cap.


9: 247-272
Madigan et al., 2012 - Cap. 12

Aula 8: Micro-organismos e
Engenharia Gentica

Ao final desta aula o estudante dever ser capaz:


- Reconhecer o papel e a importncia dos micro-organismos
na engenharia gentica
- Identificar as principais etapas e elementos necessrios para
a clonagem de genes
- Explicar como as enzimas de restrio e a DNA ligase so
utilizadas para construo de plasmdeos recombinantes
- Descrever estratgias que possibilitam a identificao de
bactrias recombinantes
- Reconhecer problemas associados com a clonagem de genes

Aula 8: Micro-organismos e
Engenharia Gentica

1. Introduo
Engenharia Gentica ou
Tecnologia do DNA
Recombinante (1973)
Micro-organismos importantes ferramentas

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Engenharia Gentica

Vantagens da utilizao de micro-organismos


Fcil cultivo Baixo custo
Obteno de um grande nmero de clulas
em um curto perodo de tempo
Produo de compostos por tempo indefinido

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Engenharia Gentica

E. coli produtora de insulina

E. coli geneticamente
modificada

Cristais de insulina produzidos


pela E. coli

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Engenharia Gentica
2.
Vetor

Viso Geral
da Engenharia
Gentica

3.
Hospedeir
o

1.
Gene
de
interes
se

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Engenharia Gentica

Caractersticas do hospedeiro ideal


Aceitar o DNA exgeno sem provocar
modificao no gene
Permitir a seleo das clulas que
apresentarem o DNA exgeno

Baixo potencial de proliferao no meio


ambiente

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Engenharia Gentica

Fonte: Paulo Donato Castellane

Exemplos do micro-organismos
hospedeiros

Bactrias: E. coli

Leveduras: S. cerevisiae

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Engenharia Gentica

Caractersticas do vetor ideal


Apresentar propriedades que facilitem sua
ligao ao DNA que vai ser clonado
Duplicar o DNA exgeno
Apresentar marcadores para a seleo

Vetor de clonagem ideal

Regio em que o DNA


Exgeno ser
inserido

Plasmdeo
Vetor de clonagem

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Engenharia Gentica

Construo de uma bactria recombinante


1. Isolamento
do DNA
doador
2. Isolamento
do gene de
interesse

3. Isolamento do
DNA do vetor

4. Tratamento
com enzima de
restrio e
ligao
5. Transformao
da clula
hospedeira
6. Identificao
da clula
recombinante

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Clula intacta

1. Isolamento
do DNA doador

DNA
Lise celular

Liberao do DNA

Purificao
do DNA

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2. Isolamento do gene de interesse


-

PCR: Reao em cadeia da polimerase Replicao in vitro

- Fita molde - DNA ou cDNA


- dNTPS (A, G, T, C)
- DNA-polimerase (Taq pol)
- Primers - que flanqueiam a sequncia do gene de interesse

Produz vrias cpias do gene de


interesse

PCR: Reao em Cadeia da


Polimerase
30-40 ciclos em 3
2. Reao de PCR

passos:
Passo 1:
Desnaturao

Passo 2:
Anelamento

Passo 3:
Extenso

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3. Isolamento do DNA plasmidial


Plasmdeo

Cromossomo

Centrifugao em gradiente de CsCl

Lise celular
Liberao do
DNA plasmidial e
cromossmico

Cloreto de
csio e
brometo de
etdeo

DNA cromossomal
DNA plasmidial

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4. Enzimas de restrio
Presentes em quase todos os micro-organismos
Reconhecem e clivam stios especficos na sequncia
do DNA (4-6 pares de bases)
Produo de terminais cegos ou coesivos

Terminais cegos

Terminais coesivos

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Enzima de restrio EcoRI


Stio especfico

Clivagem

Extremidades coesivas

Os fragmentos de
DNA unem um ao
outro por
complementaridad
e!

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Ao das
enzimas de
restrio

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Exemplos kits de biologia molecular


Kit de extrao de
DNA genmico

Kit de extrao de
DNA plasmidial

Kit de clonagem
de DNA

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Transformao
Mtodo utilizado para inserir os
plasmdeos nas clulas hospedeiras
Transformao com cloreto de clcio
e choque trmico
Transformao por eletroporao

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Transformao com CaCl2 e Choque Trmico

Preparo de clulas competentes

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Transformao de E. coli

ons de CaCl2 neutralizam


cargas negativas da
membrana e do DNA
plasmidial

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Transformao por Eletroporao

Preparo de clulas competentes

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Identificao das bactrias recombinantes


1. Uso de plasmdeos com genes que conferem resistncia
a antibiticos
2. Uso de plasmdeos com genes que permitam a
deteco de bactrias recombinantes
3. Hibridizao de colnias para identificar bactrias
recombinantes

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Plasmideo
Plasmdeo
recombinante
recombinante

Plaqueamento
dos
transformantes

1) Mistura de E. coli com os


plasmdeos
2)

Cromossomo de
E. coli

Clulas transformadas
sobrevivem em
placa com ampicilina

Aplicado estmulo

3) Cultivo em gar nutriente


contendo AMPICILINA

Clulas que NO receberem o


plasmdeo morrero em placa
com ampicilina

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Deteco da
bactria
recombinante
Seleo
branca-azul

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Seleo branca-azul
Apresentam dois marcadores de seleo

DNA de interesse
inserido no meio do
gene lacZ

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Colnias branca - azul

Todas as colnias contm o


plasmdeo
Colnias azuis plasmdeo
Colnias brancas plasmdeo
recombinantes

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Hibridao de colnias
Emprego de sonda de DNA para identificar colnias contendo o
gene de interesse
As sondas de DNA so complementares ao gene desejado
Tais sondas so marcadas por radioatividade ou fluorescncia
marcao
sonda de
DNA

DNA de
interesse

Membrana

Hibridao de
colnias

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Problemas com a clonagem de genes eucariticos


em bactrias de colnias
Presena de ntrons

A bactria no reconhece as sequncias reguladoras de


ariotos
Formao de agregados proticos insolveis

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Problemas com a clonagem de genes eucariticos


em bactrias de colnias

Sntese em excesso da protena

Destruio da nova protena

Dificuldades na extrao e purificao da nova protena

Sntese de cDNA
Transcriptase reversa
- Fita molde: mRNA

A fita de cDNA
sintetizada pela
transcriptase reversa.

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Produtos
farmacuticos

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Engenharia Gentica

Produtos para
agricultura e pecuria

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Animaes no Youtube:
https://www.youtube.com/watch?v=juP6iHMIYkE
https://www.youtube.com/watch?v=GDlOE9TveCI