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Rpublique Algrienne Dmocratique et

Populaire
Ministre d l'Enseignement Suprieur et de
Recherche
Scientifique
HAMMA LAKHDHER ' Universit
Facult des sciences de la nature et de vie

Matire : Ingnierie
molculaire

1re
master
biochimie
protinesappliqu
e

Expos
Production
de
sur

Nivea
:u

recombinent comme
humain dans pichia pastoris

Prsent
:par
REHOUMA
DalalSOLTANE Teber-ZBDI Marwa -

Plan du
travails
Introduction
Dfinition de Systme d'expression de pichia pastoris
les avantages et inconvnient de pichia pastoris
Lapplication et les phnotype de pichia pastoris
Paramtres oprationnelles
Prparation de l inoculum Et support de croissance
Les phases de La fermentation

Objectif

Est d'atteindre des rendements


levs de fermentation dans des
processus qui se prolongent
pour jours au lieu des semaines
ncessaires

-1
Introduction
systme d'expression correspond l'organisme que est utilises
Quelleest
dfinition
de P.P le
? et
leur d'expression
pour exprimer
la la
protine
,on tudie
systme
?caractristique
htrologues
de levure
gnral et le
d'expression de
?Quelle
est lesenphnotypes
desystme
P.P
Quelle
est les phases
de systmes
fermentation
? Et les
P. pastoris
en particulier
. Cette
volutifs
et rentables
? paramtres de cette opration
.de fabrication du protines thrapeutiques de humain

Dfinition-2

unicellulaire mthylotrophique

utilise le mthanol comme source de carbone

promoteur trs forts AOX 1

Pichia Pastoris

Les avantages du systme et les inconvnient - 3

Facilit la purification
de protines d'intrt.
Le systme est un
.productif et rentable

Comportant des
squences de
signal qui facilit
.vecteur intgrative la scrtion de
modifications post protines
htrologues
. traductionnelles

Vecteur dexpression

MAIS
Il y a des inconvnients pour cette systme

voie de glycosylation native et limite dans


.P. pastoris , il ralise par un seul tape

La dernire tape de transfre de l'acide sialique dtre


difficile ,car une source d'acide sialique endogne est
.inconnue pour les levures

La prsence des enzymes du protases , qui


dgrad les protines htrologues instable

L'utilisation de souches htes dficientes en protases


telles contribue attnuer une telle dgradation
enzymatique

Lapplication et les phnotype de pichia pastoris - 4

Lapplication
production de produit
pour l'industrie
biopharmaceutique

et
encoure les enzymes
industriels pour un
.effet thrapeutique

les phnotypes

Les souches de P.P varient, selon leur capacit


:utilis le mthanol il y a 3 phnotype

+Mut
MutS
-Mut

phnotype a des gnes de AOX1 et AOX2 fonctionnelle et se


dveloppe sur le mthanol , les taux de croissance de mthanol
plus rapide le taux de production de protines htrologue ,
plus rapide
MutS
L'utilisation du mthanol lent , il contient un gne AOX1
perturb; le mtabolisme du mthanol dpend uniquement du
gne AOX2 transcriptionnelle plus faible, ce qui entrane des
taux de croissance plus lente
-Mut
phnotype possde deux gnes Aox perturbs et par consquent,
.ne peuvent pas mtaboliser le mthanol

Les exemples des souches


La souche
KM71, un
driv de
GS115

le gne chromosomique AOX1 est largement


supprim et remplac par le S. cerevisiae, le
gne ARG4 rsultant en fonction du gne
AOX2 beaucoup plus faible

La souche
MC100-3

est dficiente pour les deux AOX1 et AOX2 et


ne peut pas se dvelopper sur le mthanol

Les souches
SMD1168 et
SMD1165

sont dficients, respectivement, dans la


protase A, et la protase B

Les paramtres de fermentation - 5

Temprature T

mthanol

glycrol
Soit

kcal / g de 2,6
substrat
consomm / heure

kcal / g de substrat 4,5


consomm / heure

Alimentation en oxygne

Les taux de
consommation d'oxygne
pour le glycrol

Les taux de
consommation d'oxygne
pour le mthanol

mM O2 / g de 13
substrat
.consomm / heure

mM O2 / g de 35
substrat
.consomm / heure

PH
L'hydroxyde d'ammonium
est utilis pour contrler le
pH et sert galement de
.source d'azote

glycrol
0.1 5.0

mthanol
25

Prparation de l inoculum et support de croissance - 6


L'inoculum initial de(5 10% du
volume de culture initial) il compos
glycrol minimal
(MGY) qui contient
un atome d'azote de
levure base
moyenne (YNB)

de glycrol 1%
et biotine

OU

de de glycrol
minimal tamponn
(BMGY) qui
contient

peptone et
l'extrait de
levure

la prparation du milieu de culture

Le milieu de culture de fermentation prfr


est constitu d'un milieu de sels de base (BS)
contenant 4% de glycrol complts avec
une solution d'oligo-lment

BS est strilis
par la chaleur
dans le
. fermenteur

Oligo-lment
strilis par
filtration avant
de l'utiliser

Phase
1

la culture par lots deglycrol pour la cration


] [.de biomasse
Le O2 dessous (DO) estcontrle par GFRCla
Q initiale de glycrol
.dans le fermenteur
La demende en O2fortement

Phase
2

Transition de glycrol lacroissance P.P par du


mthanol le taux de DO est
faible
La rgulation de DO encascade doit tre chang la
fin de la phase 1 le taux
dO2

Phase
3

Mut

Taux- dalimentation
(3.5ml / h/L)

Maximiser les
niveaux dexpression
de protines

Cette souches trs sensibles des


[ ] de mthanol et si DO tre
dsactivs

dO2 en
prsence
dexcs de
mthanol

Mut
S
La
consommat
ion dO2
est trs
.lent

L de
formaldhyde
(la mort
cellulaire )
La mme que
Mut

DO ne peut
pas utilis

Mut

Ncessite une source de


carbone alternatif-glycrol
.ou sorbitol

MERCI