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Técnicas de biología molecular

II Semestre
Facultad de me medicina

ZOHAR ESTRADA CASSIANI
DANIELA CASTILLO CRISMATT
FRANCO ALANDETE VICTOR HUGO

¿A qué se denominan
técnicas de biología
molecular?
En principio se denomina así a todas las técnicas
de laboratorio que se usan para aislar ADN o
extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su
estado, cortarlo y pegarlo, amplificar una región
en una enorme cantidad de moléculas (clonación
de fragmentos en bacterias u otros vectores
como virus , PCR Etc.

¿para que se utilizan estas
técnicas?

Todas estas técnicas tiene diversas aplicaciones generalmente en el
diagnóstico de enfermedades hereditarias, búsqueda de alelos mas o
menos frecuentes asociados a una característica que nos interesa
seleccionar, diagnóstico de contaminación bacteriana en alimentos ,
diagnóstico viral o de infección viral (VIH, Hepatitis C, PIF, otros),
selección de marcadores moleculares para asistir en el mejoramiento
genético de una especie, test de paternidad, diagnóstico de identidad
forense, etc.

Extracción del ADN
La primera técnica que todas las demás necesitan es la extracción del
ADN, y para ello es necesario purificarlo desde cualquier tejido aunque
usualmente se hace a partir de sangre. Se basa en una serie de lavados
de la muestra y agregado de proteinasas que eliminan las proteínas del
medio, detergentes para eliminar las membranas plasmáticas y luego ir
purificando el ADN de esa mezcla de ARN proteínas y restos celulares.

.La figura muestra el pellet de células a partir del cual se obtendrá el ADN Así se ve el ADN recién extraído en alcohol.

Reacción en cadena de polimerasa (PCR) .

Objetivos Conocer: • Los fundamentos de la técnica de amplificación de ADN por PCR • Usos y aplicaciones de PCR • Ventajas y desventajas del PCR .

• Es propósito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de ADN • Se realiza la amplificación de un segmento especifico de ADN. .PCR Polimerase chain reaction • Es la amplificación de ADN in vitro por medio de la polimeracion de cadena de ADN utilizando un termociclador. teniendo poco material disponible.

PCR Polimerase chain reaction • Fue diseñada por el Dr. .hemoglobina humana. Kary Mullis en 1987 • Gano el premio nobel de química en 1993 por su invento • Utilizo el PCR para amplificación del gen de β. y el diagnostico prenatal de anemia falciforme.

.Termociclador • La PCR se realiza en un “ thermo cycler” o termociclador * Es una maquina que calienta y enfría la reacción de periodos cortos de tiempo.

Por 15 a 40 segundos El tiempo depende del tamaño del genoma . Típicamente se usa a una temperatura de 25°C – 95°.El proceso de “PCR” incluye 3 pasos básicos que se repite 25 veces o mas. 1: DESNATURALIZACION: Consiste en separar la doble hebra de ADN y convertirla en hebra sencilla.

Por eso se deja bajar la temperatura Ej: 55° C por 30 segundos. La temperatura y el tiempo puede variar entre cebadores según sea el caso.2: APAREAMIENTO O “ANNELING”: Los cebadores “primers” previamente diseñados. . reaccionan con la hebra sencilla del ADN y se pega a lugares específicos por complementariedad de base.

.3. de esta forma se sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de ADN molde. POLIMERACION O EXTENSION. Una polimerasa de ADN extiende los “primers” en el espacio comprendido entre ambos “primers”. y coloca dinucleotidos trifosfatados (dNTP´s) de 5´a 3´leyendo el ADN de 3´a 5.

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El PCR es una amplificación exponencial .

• Se remplazo la enzima por la de la bacteria “ thermus aquaticus” conocida como Taq pol . pero esta es sensitiva a altas temperaturas. la polimerasa de ADN que se utilizaba era de bacterias E.Coli. por lo que había que añadir enzimas fresca al comenzar el tercer ciclo.Polimerasa • En un principio.

poliacrilamida) a distintas concentraciones. .Análisis de muestra • La detección del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electroforético. • Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que deseamos utilizaremos diferentes medios (agarosa.

fluorescencia. radioactividad .La posterior visualización se puede realizar por bromuro de etidio (lámpara de luz UV) Tinción de plata.

análisis de fósiles. • Mutagénesis dirigida (cambios en la información contenida a través de los “primers” con mutaciones) • Investigación forense • Pruebas de paternidad . entre otros. • Análisis de ADN de cualquier organismo vivo o muerto. VIH.Aplicacion es • Detección de agentes infecciosos como : hepatitis B y C. papiloma virus.

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diagnostico. etc. secuenciar y análisis. medicina forense. . • El proceso se puede utilizar para clonar. análisis prenatales. • Se puede amplificar el ADN de cualquier organismo vivo o muerto. • Sus aplicaciones son multiples.Ventajas del “PCR” • A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar.

Desventajas del “PCR” • Se puede reproducir solamente parte del genoma en donde se conoce por lo menos una mínima secuencia 20 – 40 pd • Se necesitan “primers” específicos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar. • Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo investigador o de cualquier otro) . • La polimeracion puede tener errores al sintetizar el ADN.

pero puede ser una técnica preparativa para purificar moléculas parcialmente antes de aplicar espectrometría de masa. El ADN y ARN pueden separarse de tamaño ejecutando el ADN a través de un gel de agarosa. PCR. clonación o secuenciación de ADN. Las proteínas pueden separarse de tamaño mediante el uso de un gel de SDS-PAGE Se utiliza generalmente con propósitos analíticos. ARN. . y proteínas que pueden ser separadas por medio de un campo eléctrico.Electroforesis en gel Electroforesis en gel es una de las principales herramientas de la biología molecular. El principio básico es ADN.

MICRORRAY .

análogo a un circuito integrado.¿Qué son los microrrays? Son un tipo de biochip : es un dispositivo a pequeña escala. Estos microrrays son pequeños dispositivos de cristal con orificios rellenos de ADN marcados con sustancia fluorescente . ensamblado de moléculas orgánicas asociadas a organismos vivos En este caso las moléculas orgánicas son fragmentos de ADN seleccionados del genoma.

. Autismo etc. etc.)  Para simples diagnósticos.)  Para diagnosticar enfermedades que causan alteraciones en el ADN: ( Cáncer. Esquizofrenia.¿Para que se utilizan los microrrays?  Para detectar anomalías del ADN (delecciones .  Para reparar genes alterados. duplicaciones.

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Southern blot EDWIN SOUTHERN DESARROLLO ESTA TECNICA EN 1975 .

 El sector de ADN buscado puede ser un gen. .  Fundamento: complementariedad de bases  Se diseña una sonda con nucleótidos marcados que sean complementarios al sector de ADN buscado. Se puede utilizar para el diagnostico molecular de patologías genéticas.Southern blot  Sirve para detectar por hidrolisis la presencia de una porción de ADN en una muestra. o parte del mismo.

esta en la muestra analiza la secuencia complementaria a la sonda.Southern blot HIBRIDACION.  La doble hebra de ADN se forma por complementariedad SONDAmuestra (una de las hebras es la sonda en simple cadena y la otra es la muestra en simple cadena)  Los nucleótidos de la sonda están marcados P 32 (radiactivos) si al revelar hay marcador radiactivo presente. .

 Se revela por auto radiografía. .Pasos de la hibridación  Se agrega la sonda sobre la membrana y se incuba  Se lava para quitar el máximo de hibridaciones inespecificas.

Pasos previos a la hibridación : .

 Separación de fragmentos  Extracción del ADN Fragmentar en ADN en porciones mas pequeñas (enzimas de restricción) Separo los fragmentos realizando una corrida electroforética usando como sustrato de migración un gel (separación por tamaño) .

 Se agrega solución (NaCl) para evitar rehibridación previa al colocar la sonda. Inmovilización de los fragmentos en soporte solido  Desnaturalización con solución salina alcalina ( SIMPLE CADENA)  Transferencia a soporte solido (membrana de nylon / nitrocelulosa): por capilaridad o electroforesis: pasan del gel a la membrana. .

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Western blot .

Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas.  Las proteínas son transferidas desde el gel a la membrana electroforética .¿ Que es el Western blot?  Es una técnica analítica usada para detectar proteínas especificas en una muestra determinada.

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Northern blot .

  . Es esencialmente una combinación de desnaturalización electroforesis en gel RNA y una mancha. En este proceso de ARN está separado basado en tamaño y es transferido a una membrana que luego es sondeada con un etiquetado como complemento de una secuencia de interés.¿Qué es el Northern blot? Se utiliza para estudiar los patrones de expresión de un tipo específico de la molécula de ARN como comparación relativa entre un conjunto de diferentes muestras de ARN.

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net/BernardoOro/tecnicas-de-biologa-molecular  MICRORRAYS DESENMASCARAN ENFERMEDADES ESCONDIDAS http://www.net/jkv/micro-arrays-presentation  Wikiperdia: Western blot http://es.slideshare.slideshare.slideshare.aspx  Blot educativo de genética clásica y estructural (técnicas de biología molecular) http://genmolecular.slideshare.net/health/Molecular-Biology-Techniques-(Spanish).wordpress.news-medical.com/tecnicas-de-biologia-molecular/  Amplificación de ADN in vitrio: PCR (polymerase chain reaction) http://www.wikipedia.org/wiki/Western_blot .net/tratamiento1/fundamento-y-procedimiento-de-las-pruebas-de-western-blot?fr om_search=4  Newmwdical : técnicas de biología molecular http://www.Bibliografía  Seminario de fundamento y procedimiento de las pruebas de WESTERN BLOT http://www.net/svls89/pcr-2899058  Seminario de genética : técnicas de biología molecular http://www.