You are on page 1of 149

GENOTOKSIKOLOGIJA

Vladimir Cvetković

Literatura:

• 1. Зимоњић Б. Д., Савковић, Н., Анђелковић,
М., 1990: Генотоксиколошки агенси – ефекти,
принципи и методологија детекције. Научна
књига. Београд.

• 2. Kirkland, D.J., 2005: Basic mutagenicity tests.
Cambridge University Press. Cambridge, UK.

27.03.17 by Vladimir Cvetković 2

Tematske celine
1. Uvod (GENOTOKSIKOLOGIJA, Mutacije,
reparacija DNK)
DNK

2. Genotoksični efekti zračenja

3. Hemijski genotoksični agensi i njihovo dejstvo

4. Virusi kao biološki genotoksični agensi

5. Principi detekcije i evaluacije efekata
genotoksičnih agenasa
27.03.17 by Vladimir Cvetković 3

27. do složenih višećelijskih organizama) je veoma složen dinamički sistem kojim upravlja set informacija organizovan u vidu DNK. • Po teoriji evolucije raznovrsnost živog sveta je proizvod rekombinacije postojećih gena i mutacionog nastanka novih. Uvod • Ćelija (počev od jednoć. • Dinamika mutaciono-rekombinacionih događaja varira u zavisnosti od prisustva specifičnih faktora (mutagena) koji izazivaju promene u DNK molekulu.17 by Vladimir Cvetković 4 .03.

.03. • Ćelijski ciklus (mitoza i mejoza) i • Centralna dogma molekularne biologije 27. Šta se podrazumeva.. • Strukturu i funkciju gena (osnovni mehanizmi nasledjivanja. interakcije gena.17 by Vladimir Cvetković 5 . Da ste do sada savladali i naučili: • Osnovnu genetičku terminologiju.).. • Strukturu i funkciju DNK i proteina (osnovna znanja iz biohemije).. • Organizacija DNK u hromozome (građa hromozoma).

mehanizme kojima oštećenje nastaje. a u cilju procene rizika i zaštite zdravlja ljudi. UVOD I DEFINICIJA • Genotoksikologija. GENOTOKSIKOLOGIJA. je naučna disciplina koja se bavi detekcijom i ispitivanjem agenasa koji potencijalno imaju uticaja na proces prenošenja naslednih osobina. • Treba napraviti razliku između toksičnih i genotoksičnih materija. Materije koje izazivaju oštećenja na naslednom materijalu označena su terminom genotoksini. relativno mlada grana toksikologije. Postoji veliki broj jedinjenja koji imaju malo ili čak nikakvo toksično dejstvo na organizam. dok na molekularnom nivou mogu dovesti do različitih oštećenja. • Ona proučava supstance koje mogu da izazovu oštećenja na DNK lancu. 27.03.17 by Vladimir Cvetković 6 . usavršava eksperimentalne modele i testove.

čija svojstva je još za vreme Drugog svetskog rata (1942. • Prvi otkriveni hemijski genotoksični agens bio je sumporni mustard gas.03.17 by Vladimir Cvetković 7 . 27.) otkrila Charlote Auerbach sa saradnicima.

sa tehnološkim razvojem povećao se i broj potencijalnih genotoksičnih jedinjenja. zabranu ili kontrolu korišćenja.17 by Vladimir Cvetković 8 . • Sa razvojem industrije. tehnološki razvoj omogućio je i istraživanja na mnogo višem i sofisticiranijem nivou. • Međutim. pa samim tim i kontrolu sumnjivih jedinjenja i njihovu zamenu. • Otkriće da hemijska jedinjenja mogu imati ovakvo dejstvo pokrenulo je istraživanja na polju genotoksikologije. 27. tj.03.

03. 27.17 by Vladimir Cvetković 9 . Mutacije • Informacija zapisana u nukleotidnim sekvencama DNK lanca se verno reprodukuje u procesu replikacije • Međutim povremeno se javljaju “greške” u tom procesu pa dolazi do izmene originalne informacije • Te promene se nazivaju mutacije • Najšira definicija mutacija: Promene u naslednom materijalu koje nisu nastale usled genetskih rekombinacija ili nezavisnim razvrstavanjem hromozoma karakterističnim za mejozu prilikom formiranja gameta.

03. 27. mutacije možemo podeliti na: • Genske mutacije – promene u okviru jednog ili nekoliko nukleotida u okviru određenog gena.17 by Vladimir Cvetković 10 . • Prema tome do kakve je promene došlo na naslednom materijalu. (ovo je ujedno i uža definicija mutacija) • Hromozomske mutacije (aberacije) – promene u broju ili strukturi hromozoma.

Genske mutacije • Supstitucije parova baza .03.17 by Vladimir Cvetković 11 .zamena jednog ili nekoliko nukleotida drugim • Insercije – dodavanje jednog ili nekoliko nukleotida • Delecije – oduzimanje jednog ili nekoliko nukleotida Promene nukleotidnih sekvenci izazivaju promenu aminokiselinske sekvence u polipeptidnom lancu 27.

27.03. kao i kodon pre njega) – one ne menjaju strukturu proteina (pa time ni njihovu funkciju) koja je kodirana genom u kome se dogodila sinonimna mutacije.17 by Vladimir Cvetković 12 . • Supstitucije mogu izazvati: • Sinonimne mutacije (novonastali kodon kodira istu a.k.

u a. • “Misense” mutacije (mutacije promenjenog smisla) – za posledicu imaju promenu jedne ili više a. drugim što za posledicu ima promenu strukture proteina.03. sekvenci polipeptidnog lanca. 27.k.k.k. Promena kodona menja a.17 by Vladimir Cvetković 13 .

• “Nonsense” mutacije (besmislene mutacije) – kada kodon koji normalno kodira neku a.03.17 by Vladimir Cvetković 14 . 27.k. mutira u stop kodon.

03.k.17 by Vladimir Cvetković 15 .k.sekvenci. • Insercije i delecije mogu proizvesti: “Frameshift” mutacije (pomeranje okvira čitanja) – ako se doda ili oduzme 1 do 2 nukleotida dolazi do pomeranja okvira čitanja i do velike promene u a. 27. Ako se doda ili oduzmu 3 nukleotida onda se okvir čitanja ne pomera već dolazi do gubitka ili dodavanja 1 a. na mestu nastanka promene.

03. Genske mutacije mogu imati vrlo male efekte koji imaju mali uticaj na fenotip a sa druge strane mutacije u određenim genima mogu izazvati drastične posledice po fenotip koje variraju od štetnih do letalnih.17 by Vladimir Cvetković 16 . Npr.kod ljudi poznato je oko 4000 raznih oboljenja koje su posledica genskih mutacija. 27.

Hromozomske mutacije (obimnije. Nema promena u količini naslednog materijala: 27.17 by Vladimir Cvetković 17 .03. veće promene detektabilne pod svetlosnim mikroskopom) • Numeričke aberacije: 1.

03. • Centrične fuzije – spajanje dva nehomologa hromozoma u jedan (smanjuje se br. 27.17 by Vladimir Cvetković 18 .hromozoma).

17 by Vladimir Cvetković 19 . • Centrične fisije – cepanje jednog hromozoma na dva (povećanje broja hromozoma) 27.03.

. Klinefelter-ov. 2.17 by Vladimir Cvetković 20 . monozomija. Promene u količini naslednog materijala: . Nulizomija. Edwards-ov. trizomija. Kod ljudi posledice su poznati sindromi Patau-ov. određenog hromozoma.. 27. Down-ov. tetrazomija.. Aneuploidije – promena broja (smanjenje ili povećanje) jednog ili više hromozoma iz hromozomskog seta.. Uzrok najčešće nerazdvajanja u MI i/ili MII.03.

• Down sy. 27.03.17 by Vladimir Cvetković 21 .

Turner sy.03.17 by Vladimir Cvetković 22 . 27.

tetraploidija.03. • Poliploidije – Uvećanje ili smanjenje celog hromozomskog seta. Posledica su dispermije. 27.i cito-kineza).17 by Vladimir Cvetković 23 . Triploidija. fuzije dva zigota. endoreduplikacija DNK (replikacija DNK koju ne prati kario. Diploidija je najčešća.

03. Promene ukupnog broja gena u hromozomima (naslednom materijalu) 27.17 by Vladimir Cvetković 24 . •Strukturne aberacije: • Promene u strukturi hromozoma: 1.

terminalne. • Delecije – gubitak dela hromozoma (intersticijalne.17 by Vladimir Cvetković 25 . termino-terminalne delecije koje rezultiraju ring hromozomima) 27.03.

Različiti efekti: od povoljnih (usložnjavanje hromozoma) do štetnih i letalnih efekata. • Duplikacije – adicijom deletiranog regiona na homologi hromozom dovodi do duplikacije.17 by Vladimir Cvetković 26 . 27.03.

Promene koje ne dovode do promene ukupnog broja gena u naslednom materijalu.03. promena regulacije genske ekspresije prilikom promene položaja gena): 27. nego dovode do promene lokacije gena (one mogu ali i ne moraju odvesti do promena u fenotipu – pozicioni efekat. 2.17 by Vladimir Cvetković 27 .

03. prekinuti segment se rotira za 1800 i ponovo povezuje.17 by Vladimir Cvetković 28 . Može biti pericentrična i paracentrična 27. . Inverzije – usled nastanka dva prekida na hromozomu.

• Translokacije – premeštanje delova nehomologih hromozoma tj. 27.03.17 by Vladimir Cvetković 29 . Promene lokacije određenih hromozomskih segmenata.

melanogaster 4.7x10-5 po gametu/generaciji. • Po baznom paru/replikaciji je manja i za bakterije iznosi 10-10 do 10-9 a kod D. • Npr. coli 3. • Stopa mutacija predstavlja verovatnoću određenog mutacionog događaja i govori o prosečnoj učestalosti date mutacije. Ta učestalost se najčešće izražava po gametu i po generaciji. Spontane stope mutacija kod određenih organizama iznose: E. melanogaster 10-8 27. • Sponatana mutabilnost karakteristična je i za genske i hromozomske mutacije • Spontane mutacije su vrlo redak i slučajan događaj.03. D.17 by Vladimir Cvetković 30 .5x10-7.

i antimutator – geni • Sa druge strane promene u genetičkom materijalu mogu biti izazvane pod uticajem faktora spoljašnje sredine . • Mutator. • Pojedini geni mogu da utiču na stabilnost drugih gena što može povećati ili smanjiti učestalost mutacija.17 by Vladimir Cvetković 31 .03.mutagena 27.

• Reparacija DNK...

- Postreplikaciona rekombinaciona reparacija (pekid na
novosintetisanim lancima DNK sa greškom i sinteza
ispravnog lanca)

- SOS reparacija (kod prokariota, pokušaj ćelije da
nastavi replikaciju usled greške koja detektovana u
nekoj od kontrolnih tačaka ćelijskog ciklusa)

27.03.17 by Vladimir Cvetković 32

• Eksciziona reparacija (BER i NER)

27.03.17 by Vladimir Cvetković 33

• Fotoreaktivaciona reparacija (razdvajanje dimera
pirimidina, enzime reparacije aktivira svetlost
određene talasne dužine)

27.03.17 by Vladimir Cvetković 34

Hemijski (različita jedinjenja) .Biološki (virusi) 27.Fizički (zračenja) .03. • Podela genotoksičnih materija (mutagena): .17 by Vladimir Cvetković 35 .

“radiare”) – oblik prenosa energije kroz prostor. Genotoksični efekti zračenja • Zračenje ili radijacija (lat.17 by Vladimir Cvetković 36 . Praktično se koristi kao izvor nuklearne energije. Pri tom se emituje energija u vidu zračenja iz jezgra. 27. • Takvi elementi se nazivaju radioaktivnim elementima.03. • Pierre Curie sa svojom suprugom Marie pronašao je da se uranijum spontano pretvara u druge stabilnije elemente jer je njegovo jezgro nestabilno.

• Prirodno zračenje se smatra jednim od glavnih faktora nastanka spontanih mutacija • Prirodni radioaktivi elementi 40K. 235U i 232Th. 187Re. 238U. 87Rb.17 by Vladimir Cvetković 37 .03. 27. • Generalno zračenje može biti prirodno (iz kosmosa iz Zemlje) i veštačko (zračenje nastalo čovekovom intervencijom).

03.17 by Vladimir Cvetković 38 . Podela zračenja • Elektromagnetno – energija • Korpuskularno – energija i masa 27.

-Jonizovati znači učiniti molekul ili atom naelektrisanim (oduzimanjem ili dodavanjem elektrona) • Nejonizujuće – ne mogu da izazovu jonizaciju atoma odnosno molekula. • Jonizujuće – mogu da izazovu jonizaciju atoma odnosno molekula.. Radiotalasi.. infracrveno.. protonsko i neutronsko. Rendgentsko (X).β . 27.. γ – zračenje. α . vidljivi deo spektra svetlosti. UV zračenje.17 by Vladimir Cvetković 39 .03.

biološke i električne efekte.03. oko milion puta manja od energije γ – zračenja.17 by Vladimir Cvetković 40 . • Učestalost aberacija izazvanih UV zračenjem zavisi od stupnja ćelijskog ciklusa na kome deluje zračenje. 27. negativno deluje na proces replikacije DNK. remeti rast ćelija. • Izaziva hemisjke. • Veća doza UV zračenja može da izazove promene u ćelji pa čak i smrt ćelije. dovodi do poremećaja građe i metabolizma RNK. Nejonizujuća zračenja • Energija UV zračenja 10 do 103 eV.

Mehanizam dejstva nejonizujućih zračenja • UV zračenje oštećuje strukturu DNK lanca stvaranjem dimera pirimidina tj. • Posledica dimera jeste smanjenje mogućnosti za replikaciju DNK.03.17 by Vladimir Cvetković 41 . TC i CC. uspostavljanjem veze između susednih molekula pirimidina u DNK lancu. Ona su vrlo stabilna jedinjenja a najčešći je TT dimer. • Tri osnovna pirimidinska dimera TT. 27.

• Kod obolelih od Xerdoderma pigmentosum smanjena je sposobnost ekscizione reparacije pa je kod takvih osoba učestalost mutacija mnogo veća nego kod normalnih osoba kod kojih reper mehanizmi funkcionišu normalno.17 by Vladimir Cvetković 42 . 27.03.

elektroni i neutroni • Elektromagnetna – nosilac energije ovde je foton (X i γ zračenje) 27.17 by Vladimir Cvetković 43 . Jonizujuća zračenja • Korpuskularna – kod njih se emituju protoni.03.

17 by Vladimir Cvetković 44 . 27.03. • Pogođen ekstra energijom. atom može da izgubi elektron i postane “+” naelektrisan i u hemijskom smislu postaje vrlo reaktivan. • Prolaskom kroz materiju zračenje predaje energiju atomima i molekulima od kojih je ona sačinjena. • Izbačeni elektron može da se pripoji susednom atomu i taj atom onda postaje “-” naelektrisan i reaktivan takođe.

• Elektromagnetno X i γ zračenje takođe izaziva jonizaciju koja je posledica izbačenih elektrona. • Kod korpuskularnog α i β čestice su “+” ili ”-” naelektrisane pa one svoju energiju predaju suprotno naelektrisanim česticama sredine kroz koju se kreću • Neutronske čestice su nenaelektrisane pa napadaju jezgro atoma sredine i “izbijaju” protone. 27. Intenzitet jonizacije i promena zavisi od energije zračenja.03.17 by Vladimir Cvetković 45 .

17 by Vladimir Cvetković 46 . Dejstvo jonizujućeg zračenja na živi sistem • Dejstvo jonizujućeg zračenja može oštetiti ili ubiti ćeliju.Akutni ili hronični.Reverzibilni ili ireverzibilni 27. pa u tom kontekstu efekti mogu biti: . .03.Direktni ili indirektni. .

Pojam doze
• Doza zračenja je vrlo bitna i zavisi od jačine izvora. Učestalost
hromozomskih aberacija je pozitivno korelisana sa jačinom doze ali
postoje dokazi da preko određene gornje granice efekat jačine doze
drastično opada. Takođe efekat se razlikuje ako se ista doza primeni
jednokratno ili dvokratno.

• Ekspoziciona doza – količina jonizujućeg zračenja neophodna da se
proizvede jedna elektrostatička jedinica elektriciteta (kulon C) po
kilogramu vazduha na temperaturi od O oC. Jedinica je C kg-1

• Apsorbovana doza – deo energije zračenja koju apsorbuje jedinica mase
ozračenog materijala. Jedinica Gy (grej). 1Gy=1J/1Kg

• Ekvivalent doze – povezuje absorbovanu dozu i biološku efikasnost
zračenja jer jednake različitih tipova zračenja izazivaju različit stepen
oštećenja. Jedinica Sv (sivert).

27.03.17 by Vladimir Cvetković 47

Sa stanovišta genetike bitne su i:

• Duplirajuća doza – doza zračenja pod čijim
dejstvom nastaje dvostruko više mutacija od
prirodne spontane vrednosti.

• Genetički značajna doza – služi za procenu
potrebnog nivoa zračenja za indukciju mutacija.

• Brzina apsorbovane doze – definiše kojom
brzinom se apsorbuje određena doza. Jedinica
Gy/sat ili Sv/min. Ako se određena doza zračenja
različito deluje u zavisnosti od toga koliko dugo se
primenjuje.
27.03.17 by Vladimir Cvetković 48

Linearni transfer energije (LET)

• To je izraz za gustinu jonizacije i predstavlja
gubitak energije po dužini puta jonizujuće čestice.

• Linearni prenos energije jedne naelektrisane
čestice je srazmeran kvadratu naelektrisanja i
obrnuto srazmeran brzini kretanja čestice.

• Zato se LET povećava usporavanjem kretanja
čestice, dostižući maksimum neposredno pred
njeno zaustavljanje i onda naglo pada na nultu
vrednost.

27.03.17 by Vladimir Cvetković 49

Relativna biološka efikasnost (RBE) • Za poređenje efikasnosti pojedinih tipova zračenja koristi se pojam relativne biološke efikasnosti (RBE).03. 27.17 by Vladimir Cvetković 50 . • Ova vrednost se dobija tako što se porede doze pojedinih vrsta zračenja koje na nivou biološkog sistema indukuju promenu istog kvantiteta.

• Nedostatak teorije jeste što se u obzir ne uzima gustina jonizacije nego je pretpostavka da se svaka jonizacija dešava nezavisno i odvojeno od susednih. 27.03.17 by Vladimir Cvetković 51 . Teorija meta • Po ovoj teoriji joizujuće zračenje deluje direktno na materiju jonizujući je i pri tom je nivo oštećenja proporcionalan dozi zračenja.

Teorija slobodnih radikala • Dve faze: 1.17 by Vladimir Cvetković 52 .03. Nastajanje slobodnih radikala pod desjtvom zračenja na tkivnu tečnost 2. Oštećenje organizma pod dejstvom nastalih slobodnih radikala 27.

• 70-90% sastava organizma čini voda.
• Jonizacijom milekula vode pod dejstvom
zračenja nastaju kroz niz reakcija slobodni
radikali Ho i OHo i brzi e- koji su nestabilni i
reaktivni.

27.03.17 by Vladimir Cvetković 53

• Slobodni radikali ulaze u čitav niz reakcija
sa organskim molekulima pri čemu se
uklanjaju atomi vodonika iz njih ili čitavi
delovi molekula.

• Jedna i druga teorija se međusobno ne
isključuju, čak šta više mnogobrojni dokazi i
istraživanja ukauzuju na to da se dešavaju
uporedo.

27.03.17 by Vladimir Cvetković 54

Genetički efekti zračenja
• Efekti zračenja na hromozome

- Prvo opažanje da zraci radijuma utiču na fragmentaciju
hromozoma
- Strukturne aberacije
- Asimetrične – lako i brzo se eliminišu iz populacije jer ih
karakteriše nepravilna mejoza i produkcija nevijabilnih
gameta. Npr. Dicentrični i ring hormozomi
- Simetrične – daleko stabilnije i efikasno se prenose na
potomstvo. Npr. Recipročne translokacije i pericentrićne
inverzije
- Numeričke aberacije pod dejstvom zračenja
- Ozračivanje X zracima značajno povećava učestalost
aneuploidija kod miševa.

27.03.17 by Vladimir Cvetković 55

Slobodni radikali imaju sposobnost da eliminišu H iz svih pozicija dezoksiriboze što destrukturira pentozni šećer.03. .Pirimidini podložniji oštećenjima od purina .OHo četiri puta brže interaguje sa DNK od ostalih pri čemu je glavna meta timin. . .DNK “upakovana” histonima je 3 puta otpornija od novosintetisane DNK koja još nije kuplovana histonima.17 by Vladimir Cvetković 56 . 27.Primarni radikali koji nastaju u interakciji vode sa zračenjem mogu da izazovu oštećenja DNK. .

ali to podrazumeva samo povećanje normalne stope mutacija a ne indukovanje kvalitativno novog fenomena. • U pogledu ekspresivnosti nastalih muantnih alela delovanjem zračenja. Odnos je na strani recesivnih alela i npr.03.17 by Vladimir Cvetković 57 . kod vinske mušice je izračunato da je 5:1 za recesivne alele. 27. Efekti zračenja na nivou gena • Nedvosmisleno je pokazano da zračenje izaziva povećanje stope mutacija. aleli mogu biti dominantni i recesivni.

Prilikom zračenja od molekula vode nastaju radikali Ho i OHo ali u prisustvu kiseonika dolazi do nove reakcije i nastaje H2O2 (vodonik peroksid). .17 by Vladimir Cvetković 58 .To se objašnjava ulogom kiseonika u formiranju reaktivnih peroksida. .03.Mutageni efekti H2O2 mogu biti umanjeni dejstvom enzima katalaze 27. Faktori koji utiču na genotoksične efekte jonizujućih zračenja • Zavisnost efekta zračenja od prisustva kiseonika – ćelije ispoljavaju povišenu osetljivost na delovanje jonizujućeg zračenja u prisustvu kiseonika.

Osetljivost ćelija na zračenje je različita i značajno je zavisna od vrste.03.Od svih ćelijskih konstituenata najveću osetljivost pokazuje DNK (zračenje menja strukturu i usporava sintezu DNK) 27. stepena diferentovanosti. .Mlađe i manje diferencirane ćelije su osetljivije na delovanje jonizujućih zračenja .17 by Vladimir Cvetković 59 . starosti. • Zavisnost efekata od faze životnog ciklusa ćelije .Kako se smanjuje sposobnost ćelije za deobu tako se smanjuje i njena radiosenzitivnost . metabolizma i intenziteta deobenih procesa.

03. 27. • Efekti jonizujućeg zračenja su manji ako je do ozračivanja došlo u G1 (presintetskoj fazi) ćelijskog ciklusa nego u G2 (postsintetskoj fazi). • Ozračivanje u S fazi dovodi do različitih efekata koji variraju od stepena replikacije.17 by Vladimir Cvetković 60 .

zapažaju se pretežno hromatidne aberacije • Direktna ćelijska smrt može biti indukovana zračenjem ako se pri tom oštete jedarce i centriole.zapažaju se hormozomske i hromatidne aberacije . 27.17 by Vladimir Cvetković 61 .G2 fazi .G1 fazi – zapažaju se strukturne hormozomske aberacije . • Ako se ozračivanje desilo u: .03.S fazi .

27. • Uticaj zračenja na ćelije u gametogenezi . dijakinezis i II mejotička profaza.03. .Ćelije u mejozi su znatno osetljivije na zračenje nego ćelije u mitozi.17 by Vladimir Cvetković 62 . a čak 10 puta osetljivije od ćelija u mirovanju.Najosetljiviji stadijumi u mejozi diploten.

Kod sisara osetljivost od najviše ka najnižoj: rane spermatide. spermatocite. . spermatozoidi i na kraju spermatogonije 27.17 by Vladimir Cvetković 63 .03.Kod D. Primeri . melanogaster ženki (od najviše ka najnižoj) hijerarhija osetljivosti je sledeća: primarne oocite. zreli spermatozoidi i na kraju spermatogonije. oogonije. melanogaster mužjaka (od najviše ka najnižoj) hijerarhija osetljivosti je sledeća: speramtocite II reda. Spermatocite I reda. sekundarne oocite. . nezreli spermatozoidi.Kod D.

Protozoe 1000-5000 Gy i .03. . Međuvrsne razlike u osetljivosti na jonizujuća zračenja • Organizmi na različitim evolutivnim stupnjevima se razlikuju u pogledu osetljivosti na jonizujuće zračenje. Biljke 6-75 Gy.17 by Vladimir Cvetković 64 . • Poluletalna doza (LD50) u Gy (Grej) za: . . . Ribe i vodozemce 40-100 Gy. Sisare je 3-9 Gy. 27. . Bakterije 40-700 Gy. Insekte 50-500 Gy.

17 by Vladimir Cvetković 65 . Zašto su evolutivno stariji organizmi otporniji? • Stepen oštećenja u pozitivnoj korelaciji sa veličinom. brojem i količinom DNK • Veća količina naslednog materijala predstavlja veću metu za dejstvo zračenja.03. 27. • U drugu ruku kod poliploida se ne menja tako značajno osetljivost na zračenje sa povećanjem broja hromozomskog seta. • Udvostručenje broja hromozoma (sa n na 2n) udvostručuje osetljivost na zračenje.

Pesticide. • 5. Hemijski genotoksični agensi i njihovo dejstvo • Podela hemijskih genotoksina prema poreklu: • 1. kontraceptivi). • 2.Genotoksične agense industrijskih procesa. • 3. citostatici.Kozmetička sredstva. narkotici. 27.17 by Vladimir Cvetković 66 .03. • 4.Genotoksične agense hrane. • 6. • 7.Farmaceutska sredstva (antibiotici.Genotoksične agense vode.Genotoksične agense prirodnog porekla. anestetici.

jedinjenja koja se normalno nalaze u biljkama. koji dokazano imaju mutageno i karcinogeno dejstvo. a među kojima je značajno pomenuti kafein. najčešće nekih gljiva. • Bitnu grupu čine i aflatoksini – produkti metabolizma gljiva roda Aspergillus.17 by Vladimir Cvetković 67 . • Veliku grupu čine alkaloidi. ali nije dokazano da indukuju mutacije.produkti biosinteze biljaka određenih familija. • Kao genotoksični agensi navode se i pirolizidini .03. • Za njih je otkriveno da uzrokuju hromozomske lezije. U genotoksične agense prirodnog porekla ubrajaju se jedinjenja koja nastaju kao metabolički produkti organizama. 27. kvasaca i biljaka. • 1. teofilin i teobromin.

27. • 2.17 by Vladimir Cvetković 68 . • Ovo je veoma heterogena grupa jedinjenja koju čine različiti alkilirajući agensi. • Među bitnijim grupama jedinjenja koja tu spadaju nalaze se i: aldehidi i dialdehidi (npr. Genotoksični agensi industrijskih procesa jesu jedinjenja koja se koriste u proizvodnom procesu ili su pak sastavni deo konačnog proizvoda industrijskog procesa. etilenoksid) i diepoksidi.03. olova. • Od neorganskih jedinjenja ovde spadaju soli nikla. arsena itd. formaldehid) zatim epoksidi (npr. organska jedinjenja metala. organski rastvarači.

• 3.17 by Vladimir Cvetković 69 .03. Razblaženja u prirodnim izvorima su tolika da se standardnim testovima njihovo prisustvo ne može dokazati. a zbog potencijalne akumulacije genotoksina u telu. u procesu hlorinacije vode u vodovodima. Genotoksični agensi u vodi teški su za dokazivanje. • Međutim. stvaraju trihlormetan i hlorfenoli koji imaju genotoksično dejstvo. 27. životinje i biljke unose u organizam. • Otkriveno je da se. zbog količine koju čovek. bilo je neophodno prilagoditi testove ovoj nameni.

najčešće termičke. benzopiren).17 by Vladimir Cvetković 70 . konzervansi i antioksidansi). • U genotoksične agense hrane mogu se ubrojati i različita hemijska jedinjenja koja se hrani dodaju u cilju poboljšanja njenih karakteristika (boje.nitrozamin. • 4.03. Genotoksični agensi u hrani mogu biti produkti metabolizma biljaka ili gljiva koje se mogu naći na žitaricama ili nekim drugim biljkama (npr. kao i veštački zaslađivači. mirisi. • Naročitu pažnju u zadnje vreme privlače nitriti i nitrati. 27. aflatoksin iz gljive Aspergillus flavus) ili mogu nastati u procesu. obrade hrane (npr.

ne menjajući strukturu DNK. podeljeni su na osnovu njihove sposobnosti da. organohlorna jedinjenja (DDT. 27. Pesticidi. • Primeri aktivnih komponenti su: alkilirajući agensi (organska halogena jedinjenja-Cl/BR-metan).). heptahlor i sl. piretrini.03. • Ovi procesi se zasnivaju na delovanju aktivne komponente pesticida.aletrin (insekticid). • 5. derivati fluorsirćetne kiseline (rodenticidi). utiču na enzimske procese u ćeliji.17 by Vladimir Cvetković 71 . gledajući sa genotoksičnog aspekta.

narkotici. etilviniletar). citostatici (Mitomycin. Metotreksat). diviniletar.17 by Vladimir Cvetković 72 . Doksorubicin. anestetici (Metoxifluran. . Daunorubicin). fenotiazini).03. Farmaceutska sredstva najčešće su ispitivana jedinjenja zbog široke upotrebe i česte primene. Bleomycin. • Među preparatima sa genotoksičnim svojstvima našli su se neki: . • 6. 27. . kontraceptivi. . antibiotici (Streptomycin... psihofarmatici (hlorpromazin. .

Kozmetička sredstva zainteresovala su istraživače zbog česte primene.17 by Vladimir Cvetković 73 . • 7. • Otkriveno je da aromatični amini i neki drugi aditivi koji ulaze u sastav kozmetičkih preparata mogu da izazovu oštećenja DNK.03. što omogućava njihovu zamenu u budućoj upotrebi. • Među prvima su ispitivane boje za kosu. 27. • Važnost ovakvih ispitivanja je u tome što se detektuju potencijalni ili potvrđeni mutageni.

NADP-zavisne citohrom P-488/P-450 oksidaze) 27. imini i halogeni derivati) . Mali broj jedinjenja deluje kao direktni mutagen (mono i bifunkcionalni alkilirajuću agensi.17 by Vladimir Cvetković 74 . Nasuprot njima najveći deo mutagena nije elektrofilan pa ne deluje direktno na nukleinske kiseline (promutageni) . . Za transformaciju promutagena u mutagen (elektrofilna reaktivna jedinjenja) zaslužni su enzimi u organizmu (npr. Različito dejstvo istih jedinjenja in vitro i in vivo. epoksidi. neki nitrozamidi. Mehanizmi delovanja hemijskih genotoksičnih agenasa i promene koje izazivaju • Metabolička konverzija promutagena u mutagen (prokarcinogena u karcinogen) .03.

pa predstavljaju opasnost po nasledni materijal jer se dugo zadržavaju u ćeliji * Za detaljnije informacije o mehanizmima reakcija i specifičnim jedinjenjima pogledati u knjizi ili na internetu 27.17 by Vladimir Cvetković 75 . zasnivaju se na evolutivno razvijenim mehanizmima za detoksikaciju (enzimsko razlaganje polaznog jedinjenja koje se ne koristi u organizmu do derivata koji su rastvorljivi u vodi da bi se izlučili iz organizma) – neželjena posledica aktivnosti mehanizma za detoksikaciju • Ponekad se formiraju takvi reaktivni intermedijeri koji su slabo podložni daljoj enzimatskoj transformaciji. paradoksalno.03. • Mehanizmi prevođenja promutagena u mutagen.

Enzimatska 32P fosforilacije (obeležavanje molekula koji se prate) 27.Imunološki postupci sa specifičnim antitelima .Fluorescentna spektroskopija . RNK i proteinima • Istraživanja interakcija se zasnivaju na sledećim metodama: .03.17 by Vladimir Cvetković 76 . Interakcija mutagena sa DNK.

03.17 by Vladimir Cvetković 77 . • Većina mutagena kovalento interaguje sa nukleinskim kiselinama • Pojedina mesta u DNK karakteriše izrazita hemijska reaktivnost – nisu svi delovi DNK podjednako “osetljiva”. 27. • Najreaktivnija mesta: N atomi u purinskim prstenovima (posebno N-7 kod guanina i N-3 i N-7 u prstenu adenina) • Osim ovih skoro sve ostale funkcionalne grupe takođe učestvuju u formiranju kako kovalentnih tako i vodoničnih veza.

ugljovodonici i neki antibiotici .Interkalacija (umetanje u DNK molekul) Primer: akridinske boje.03.Adlineacija (spoljašnje vezivanje) – do interakcije dolazi na mestima koja ne učestvuju u vodoničnim vezama dve naspramne baze.aromat. 27. • Poseban tip interakcije DNK i mutagena predstavljaju nekovalentne interakcije koje su određene molekularnom geometrijom agensa (ako je adekvatna omogućuje nekovalentno vezivanje agensa za DNK) • Dva načina vezivanja: . policik.17 by Vladimir Cvetković 78 .

• Hemijski mutageni koji interaguju sa proteinima obično imaju izražen afinitet prema pojedinim a. Interakcija mutagena sa RNK i proteinima • Princip interakcije je sličan kao i sa DNK • Za sada nema dokaza da neki mutagen interaguje samo sa RNK zaobilazeći DNK • Postoje i dokazi koji ukazuju da određeni broj mutagena interaguje sa većim brojem polipeptida i proteina. 27.03. u proteinu.17 by Vladimir Cvetković 79 .k.

17 by Vladimir Cvetković 80 . RNK i proteinima • Pojedini produkti kovalentnih interakcija mutagena sa DNK su nestabilni pa kao rezultat nastaju apurinska i apirimidinska mesta • Navedene promene indukuju mehanizam za reparaciju DNK (odstranjivanje lezije i resinteza nedostajućeg dela) 27.03. Strukturne i funkcionalne posledice interakcije mutagena sa DNK.

Pojava ukrštenih veza (“cross links”) – intrAlančane ili intErlančane veze koje rezultuju blokadom replikacije u tom delu pa nastaju prekidi u novosintetisanim lancima DNK. • Mutageni (alkilirajući agensi) mogu dovesti i do promene hemijskog sastava baza pri čemu nastaju metil.Deaminacijom C-5-metil-citozin nastaje timin.Nepravilno sparivanje u procesima replikacije (alkilirane baze menjaju afinitet prema komplementarnim bazama) . raspar što ako se ne reparira dolazi do fiksirane mutacije (point) u narednoj replikaciji . 27.ili etil- derivati (npr.03.17 by Vladimir Cvetković 81 . • Posledice nastanka ovakvih derivata mogu biti različite: . što uzrokuje mismatch tj. C-5-metil-citozin).

17 by Vladimir Cvetković 82 . • Alkilirajući agensi mogu da dovedu do izvesnog stepena metilacije iRNK što rezultuje disocijacijom ribozoma ili poremećajima u dinamici translacije 27.03. • Interkalirajući agensi koji produkuju stabilne strukture u interakciji sa DNK dovode do frameshift mutacija i na taj način dolazi do pomaka u prepisivanju originalne DNK sekvence.

03.17 by Vladimir Cvetković 83 .. 27. Virusi kao biološki genotoksični agensi • Živa bića ili ne? I dalje traje debata..

17 by Vladimir Cvetković 84 .03. • Obligatni intraćelijski organizmi • Van ćelije su inertna kompleksna hemijska jedinjenja (pokretni geni. parazitske forme gena) • Koevoluirali sa drgugim živim organizmima. • Kapsid štiti geom viriona i omogućava njegovu adheziju i prodor u ćeliju domaćina 27. • Genom virusa mogu činiti jednolančana ili dvolančana DNK ili RNK koje sa kapsidom (proteinskim omotačem) čine nukleokapsid – osnovne slobodne delove infektivne čestice – viriona.

• Na osnovu toga na koji se način prepisuju informacije na iRNK virusi se dele u 6 grupa: 1. Dvolančana DNK (npr. Virus poliomielitisa i togavirusi) 5. Jednolančana DNK (imaju ili “+” ili “–” lanac. npr. Jednolančana RNK (“–” lanac. Proxiviridae) 2. npr. Jednolančana RNK (“+” lanac. npr. Dvolančana RNK (“+” i “–” lanac) 4. Parvoviridae) 3. Virus influence) 6.17 by Vladimir Cvetković 85 .03. Adenoviridae. Jednolančana RNK (“+” lanac Retrovirusi) 27.

27.03.17 by Vladimir Cvetković 86 .

27.03. • Dužina nukleinske kiseline viriona varira od 3 – 300Kb • Par stotina gena u genomu • Osim nekih retrovirusa svi ostali u fazi viriona sadrže jednu kopiju gena (haploidi) • Sa stanovišta genetičke toksikologije važan deo u životnom ciklusu virusa jeste onaj kada se virus (delom ili u celosti) integriše u DNK domaćina u vidu provirusa. • Na taj način on postaje sastavni deo nasledne informacije ćelije domaćina i prenosi se na naredne potomačke ćelije.17 by Vladimir Cvetković 87 .

• Aberacije do koje mogu dovesti su tipa prekida hromozoma.17 by Vladimir Cvetković 88 .03. • Parcijalno inaktivisani virusi (koji su osnovni sastojak vakcina) mogu bitni potentni induktori mutacija. Virusna indukcija genskih i hromozomskih mutacija • Virusi su sposobni da indukuju genske i/ili hromozomske mutacije i kod nižih (Actinomycete) i kod viših organizama (D. delecija i translokacija 27. Melanogaster i drugi insekti. čovek i drugi sisari). • Međutim određeni regioni su podložniji dejstvu virusa od ostalih.

03. • Kod RNK virusa prvo dolazi do reverzne transkripcije u DNK a zatim se ona inkorporira u DNK domaćina i izaziva mutaciju okolnih delova hromozoma. • Mehanizam indukcije mutacija virusa iz grupe DNK-viroidea je direktna insercija delova viralnog genoma u hromozomsku DNK domaćina.17 by Vladimir Cvetković 89 . 27.

ras.03.17 by Vladimir Cvetković 90 . drugačije nazvanih protoonkogenima ili ćelijskih onkogena) • Neki od ćelijskih onkogena (src. Posledice interakcije virusnih nukleinskih kiselina sa naslednim materijalom ćelije domaćina • Retroviralni genom sadrži dve klase gena: . myc.Onkogene (njihovi produkti su osnova neoplastične transformacije ćelije domaćina) • Pronađena je izrazita homologija između retrovirusnih onkogena (v-onc) i izvesnih ćelijskih gena (c-onc.Virogene (kodiraju proteine virusnog kapsida) . alb) se sreću kod evolutivno udaljenih organizama što označava da su oni konzervativni 27.

odnosno. i insercije delova virusnog genoma 27. potpadanjem gena pod kontrolu virusnih promotora (usled insercije virusnih sekvenci iznad gena ili transdukcijom protoonkogena u retroviralni genom) . Promena specifičnih svojstava krajnjeg genskog proizvoda usled mutacije.03.17 by Vladimir Cvetković 91 . usled oštećenja regulatornih mehanizama . • U osnovi izvesnog broja malignih oboljenja leži poremećena funkcija ćelijskih onkogena koji se može manifestovati kao: . koja može biti posledica. Aktivacija neaktivnog protoonkogena ili neprekidna aktivnost gena. Znatno povišena transkripciona aktivnost uslovljena genskom amplifikacijom ili translokacijom gena u zonu pod kontrolom aktivnog promotora. između ostalog.

• Interesantno je da se većina pozicija fragilnih mesta na hromozomima kod čovek podudara sa lokacijama protoonkogena. protoonkogeni i fragilna mesta • Indukcija neaktivnog protoonkogena (c-onc) može se dogoditi i bez njegove translokacije i to usled integracije virusnog homologa (v-onc). modulacije nivoa transkripcije • Inserciona mutageneza – insercijom virusne DNK dolazi do strukturnog rearanžmana u hromozomima što dovodi do izmene krajnjeg produkta gena.17 by Vladimir Cvetković 92 . integracija virusne DNK može da dovede do aktiviranja neaktivnih ćelijskih gena. 27. • Dakle.03. Integracije virusnih DNK.

• Blizu 71% virusnih integracija pogađa lokacije identifikovanih protoonkogena ili njima susedne segmente DNK 27.03.17 by Vladimir Cvetković 93 . Statistika: • U 90% slučajeva do integracije virusa dolazi u neposrednoj blizini hromozomskih fragilnih mesta ili upravo u njima.

Genotoksičnost virusa: neke implikacije • Antivirusne vakcine sa delimično “onesposobljenim” (atenuiranim) virusima dovodi do povećanja rizika od mutacija. • S obzirom da su vakcine nezamenljive za neke bolesti.03. treba ubuduće raditi na produkciji vakcina koje će biti lišene virusnih nukleinskih kiselina. gde se virusi koriste kao vektori za isporuku i ugradnju željenih gena u željeni genom treba imati u vidu da može biti takođe potencijalno opasna.17 by Vladimir Cvetković 94 . 27. • Genska terapija koja je takođe budućnost medicine.

Principi detekcije i evaluacije efekata genotoksičnih agenasa • Genetička toksikologija se upravo razvila iz potrebe za detekcijom genotkoskičnih agenasa u čovekovoj okolini. • Jedan od osnovnih zadataka jeste i praćenje svih vrsta promena u genetičkom materijalu – gentičkim u kombinaciji sa klasičnim toksikološkim metodama. 27.17 by Vladimir Cvetković 95 .03.

• Teoretski. svaka tehnika koja omogućava detekciju oštećenja DNK može se koristiti za identifikaciju genetičke toksičnosti. u praksi prilikom kreiranja metoda i strategija za detekciju genotoksičnosti treba voditi računo o biloškim specifičnostima test organizama jer: – Kod različitih organizama molekuli genotoksina različito interaguju sa DNK bez obzira na njenu univerzalnu strukturu – Veličina molekula DNK se razlikuje među organizmima – Karakteristike i dinamika procesa reparacije DNK je različita 27. • Ipak.17 by Vladimir Cvetković 96 .03.

Testove kojima se detektuju hromozomske mutacije i 3.03. Testovi za otkrivanje efekata na nivou DNK 27.17 by Vladimir Cvetković 97 . Testove kojima se detektuju genske mutacije. • Na osnovu genetičkog efekta koji detektuju testovi se dele na: 1. 2.

Testovi za detektovanje genskih mutacija • Test reverznih mutacija kod Salmonella typhimurium • Test polno vezanih recesivnih mutacija kod Drosophila melanogaster • SMART (Somatic Mutation and Recombination Test) na Drosophila melanogaster –Wing Spot Test • Spot test kod miševa 27.17 by Vladimir Cvetković 98 .03. 1.

17 by Vladimir Cvetković 99 .03.Test izmene sestrinskih hromatida (SCE) in vitro 27. 2. Testovi za otkrivanje efekata na nivou DNK . Testovi za detekciju hromozomskih mutacija – Mikronukleus test 3.

17 by Vladimir Cvetković 100 . Strategija testiranja genotoksičnosti • Vrednost testa je utoliko veća ukoliko test-sistem više imitira uslove ljudskog organizma • Zato je veća vrednost in vivo nego in vitro testova • U istom smislu testovi na eukariotskim organizmima imaju prednost u odnosu na testove na prokariotskim organizmima • Sisarski sistemi imaju prednost nad nesisarskim sistemima 27.03.

17 by Vladimir Cvetković 101 .03. Tip ćelija na kojima se detektuje genotoksičnost • Testovi koji detektuju genotoksične efekte na germinativnim ćelijama imaju veću primenljivost i pouzdanost za predvidjanje mutagenog efekta i rizika nego testovi na somatskim ćelijama 27.

Ekonomičnost testova • S druge strane najekonomičniji testovi su in vitro testovi a pogotovu testovi na mikroorganizmima • Mada postoje i in vivo testovi koji su ekonomični – SMART npr.17 by Vladimir Cvetković 102 . 27.03.

17 by Vladimir Cvetković 103 .03. Strategija • Zbog svega navedenog. prihvaćen je stav da donošenje odluke visokog stepena sigurnosti o tome da li je ili nije neka supstanca genotoksična potrebno je izvršiti testiranje agenasa putem serije odabranih testova. • U tom mislu postoje dve glavne strategije: – Hijerarhijski fazni pristup – Matriksni pristup (baterija testova) 27.

17 by Vladimir Cvetković 104 . Na mikroorganizmima) • Ako je rezultat negativan posle 1. nivou 27. Hijerarhijski pristup (3 nivoa testiranja) • Screening faza je 1. nivoa testiranja onda se odustaje od dalje analize • Ako je pozitivan onda se pristupa 2. nivo testiranja je efikasan brz i pouzdan i relativno jeftin (npr.03.

• Pozitivan test na drugom nivou kvalifikuje test supstancu za 3.03.melanogaster i in vitro sisarske ćelijske kulture) • Ako je test negativan na ovom nivou istraživanja onda treba sprovesti dodatna ispitivanja zašto je test supstanca bila genotoksična na 1.17 by Vladimir Cvetković 105 . nivo • Ovde se obezbedjuje detekcija genotkosičnog efekta na višećelijskim eukariotskim organizmima (D. nivo (kada se radilo na mikroorganizmima) a nije škodljiva na eukaiotskim organizmima. nivo ipitivanja 27. 2.

Nivo ispitivanja • Kvantifikacija stvarnog mutacionog rizika na čoveka.17 by Vladimir Cvetković 106 . 3. i 2. pre svega fiziološki (npr. Sitni glodari) • Negativan rezultat na trećem nivou posle dva pozitivna na 1. • Pozitivan rezultat na trećem nivou kvalifikuje test supstancu kao visoko rizičnu po čoveka i treba je u svakom smislu skloniti iz ljudske upotrebe i okoline 27. ukazuje da je rizik po čoveka mali.03. • Zato je u ovoj fazi najbitnije da test organizmi budu što je više moguće sličniji čoveku.

ne više od 5 testova sa različitim nivoom detekcije koji se izvode simultano.03. • Procena genotoksičnosti ispitivanog agensa i evaluacija rizika po čoveka vrši se na onovu rezultat dobijenih iz odabranih testova. • Princip izbora testova u ovom pristupu je delikatan • Baterija testova bi trebala da sadrži: – Jedan mikrobijalni test ili jedan test na D. mealnogaster – Citogenetički in vitro ili in vivo test na sisarima – Test za povratne mutacije u kulturi sisarsih ćelija – In vivo test na sisarima 27. Matriksni pristup (sistem baterije testova) • Sastoji se od nekoliko.17 by Vladimir Cvetković 107 .

17 by Vladimir Cvetković 108 . 27. • Detekuje široki spektar mutagena Najčešće se koristi za “prescreening” genotoksičnog dejstva pojedinih hemijskih jedinjenja.03.Ames sa sardnicima 70-tih godina prošlog veka • Poznat i kao Amesov test i izvodi se na pomenutoj vrsti bakterija pa spada u in vitro mikrobijalne testove.N. Test reverznih mutacija kod Salmonella typhimurium • Ovaj test za detekciju povratnih mutacija na Salmonella typhimurium kreirao je B.

17 by Vladimir Cvetković 109 .03. može doći do povratne mutacije i tako histidinski operon postaje aktivan pa tako novonastale bakterije mogu da opstanu i na podlozi bez histidina. 27. • Dejstvom mutagena. • Test se zasniva na to da bakterija koja se koristi ima mutaciju na histidinskom operonu. • Samim tim takve bakterije ne mogu da sintetišu aminokiselinu histidin tako da ovakve bakterije zahtevaju podlogu obogaćenu histidinom – dakle ne rastu na podlogama bez histidina.

Rastvorljivost.03.17 by Vladimir Cvetković 110 . • Uobičajeno je da se na osnovu predhodno obavljenog testa za toksičnost. • Ako se ne rastvara u vodi onda se pristupa rastvaranju u nekom koncentrovanom organskom rastvaraču DMSO. kao najviša koncentracija ispitivanog agensa pri testiranju na genotoksičnost uzme doza koja odgovara LC 50 plus četiri niže koncentracije kao i negativna kontrola odnosno samo rastvarač bez test supstance. aceton ili etanol. onda se prvo to utvrđuje. • Posebno voditi računa o toksičnosti rastvarača – njegova koncentracija mora biti takva da bude neutralan u eksperimentu 27. toksičnost i doziranje • Ako ne znamo u čemu se rastvara supstanca koju želimo da testiramo.

6% NaCl. • Važno je imati negativnu kontrolu – koja sadrži samo rastvarač bez test supstance i pozitivnu kontrolu koja predstavlja test podlogu sa dodatkom poznatog mutagena. Vrednosti dobijene za test supstancu će biti između vrednosti kontrola. • Test podloge se formiraju tako što se pored standardnih komponenti 0.17 by Vladimir Cvetković 111 . • Svrha kontrola jeste da se odrede gornja i donja granica da bi mogla da se uoči razlika sa test supstancom.03.6% agra i 50uM histidin/biotin dodaju različite koncentracije test supstance. 27. 0.

27. • Ako se ne može odmah pristupiti brojanju. rast kolonija se može stopirati tako što se podloge sa bakterijama smeste na 40 C • Prosto rečeno rezultati se mogu iskazati kao broj kolonija po petri šolji. • Statistički značajan porast revertanata u odnosu na kontrolu smatra se pozitivnim rezultatom. prosečan broj kolonija po petri šolji zajedno sa standardnom devijacijom. • Petri šolje se ikubiraju na 370 C u trajanju od 48 sati nakon čega se pristupa prebrojavanju kolonija revertanata.03.17 by Vladimir Cvetković 112 .

17 by Vladimir Cvetković 113 .27.03.

17 by Vladimir Cvetković 114 . Test polno vezanih recesivnih mutacija kod Drosophila melanogaster (SLRL) • Mušice iz roda Drosophila jedan su od najpogodnijih eukariotskih višećelijskih organizama za mnogobrojna laboratorijska istraživanja u biologiji a pogotovu u genetici. 27.03. • Veliki broj različitih test linija omogućavaju sa velikim stepenom preciznosti otkrivanje različitih indukovanih genskih i hromozomskih alteracija.

melanogaster • Pokriva recesivne letalne mutacione promene na oko 800 gena smeštenih na X hromozomu kod D.03.17 by Vladimir Cvetković 115 . • SLRL je kratkotrajan i vrlo efikasan test i vrlo senzitivan test sa procentom korelacije 81%-91% • Ovaj test meri frekvencu genskih mutacija i malih delecija u germinativnim ćelijama mužjaka D. melanogaster • Nasledne promene se mere na netretiranom potomstvu pa se samim tim dobija stvarni nasledni efekat 27.

17 by Vladimir Cvetković 116 . pogođeni su mužjaci jer su oni hemizoti za letalni recesivni alel pa se muške jedinke neće izleći ako su nosioci letalnog alela! • Heterozigotne ženke preživljavaju ali polovina mužjaka potomaka takvih ženki će sigurno biti nosioci letalnog alela i neće se izleći! 27. • Ako se letalni alel nalazi na X hromozomu.03. Princip testa • Recesivne letalne mutacije dovode do uginuća jedinki koje ih imaju u svom genotipu u homozigotnom stanju. u heterozigotu se ne ispoljava efekat recesivnog letalnog alela.

03.17 by Vladimir Cvetković 117 . • Za ovaj test se koriste dve laboratorijske linije D. melanogaster: • “Oregon” (ima fenotip “divljeg tipa” i nije nosioc letalne recesivne mutacije) 27.

03.• “Basc” (linija koja nosi recesivne genske mutacije) • Basc – vidljivi fenotipski markeri – Bar složeno oko – Apricot boja očiju – Redukovana dužina torakalnih čekinja 27.17 by Vladimir Cvetković 118 .

• X hromozom je invertovan tako da formira specifičan oblik – tzv. “Basc” hromozom • Inverzija sprečava da nasledne promene nastale tretmanom mužjaka budu inkorporirane u X hromozom koji potiče od ženki. 27. • Tako se sigurno X hromozom (bez promena u krosing overu) koji je izmenjen dejstvom mutagena prenosi na muško potomstvo.17 by Vladimir Cvetković 119 .03.

27.17 by Vladimir Cvetković 120 .4%! • U starijim izvorima piše da je gornja granica koncentracije DMSO-a u test podlozi 2% što se u poslednje vreme pokazalo kao netačno. Ratvaranje test supstance • U vodi ili organskom rastvaraču DMSO. aceton. etil-alkohol ili sirćetna kiselina • Najčešće se koristi DMSO koji u krajnjoj koncentraciji treba biti ne više od 0.03.

Hranjenje adulta test supstancom • Mužjaci se prebacuju u teglicama na čijem se dnu stavi filter papir natopljen test supstancom sa dodatkom 1% rastvora saharoze da bi se hranili narednih 24h. • Preporučljivo je koristiti ½ LC50 i ¼ LC50 • U slučaju da ispitivana supstanca nema toksičan efekat na jedinke onda se koristi 5% rastvor test supstance 27.17 by Vladimir Cvetković 121 . • Za duže tretmane filter papir se menja na svaka 24h.03. • Bitno je odrediti LC50 za test supstancu da bi se znalo sa kojom koncentracijom treba krenuti u testiranje na genotoksičnost.

• Svaki od tretiranhi mužjaka “divljeg tipa” prebacuje se u flakone sa hranljivom podlogom zajedno sa tri nove neoplođene ženke “Basc” linije.03.17 by Vladimir Cvetković 122 . • Nakon dva-tri dana se mužjaci prebacuju u novu teglicu sa novim ženkama i postupak se ponavlja. 27. • Ženke se uvek ostavljaju još 5 dana da bi položile jaja a zatim se i one odstranjuju sa podloge. Na taj način se formiraju tri legla.

27. • Formiranjem tri različita legla tretiranih mužjaka postiže se dobijanje gupa potomaka koje se međusobno razlikuju po tome na kom je stadijumu spermatogeneze bila germinativna ćelija pri tretmanu test supstancom.17 by Vladimir Cvetković 123 . • Poznato je da nisu svi stadijumi spermatogeneze podjednako osetljivi na dejstvo genotoksičnih supstanci.03. od koje je nastao spermatozoid koji je učestvovao u formiranju zigota.

03. uzimaju se po deset parova i prebacuju se na svež supstrat da se spare i polože jaja. • Nakon izleganja F1 generacije. • Dva dana nakon početka izleganja F2 generacije pristupa se brojanju na osnvu fenotipa • Bitno je postaviti pozitivnu kontrolu sa poznatim mutagenom (npr 3mM MMS) i negativnu koja bi predstavljala sam rastvarač da bi poređenje moglo adekvatno da se izvrši • Vrednosti dobijene za test supstancu se nalaze u granicama vrednosti za negativnu i pozitivnu kontrolu 27.17 by Vladimir Cvetković 124 .

• Ako se u teglici izleglo manje od 20 jedinki a od toga je jedan mužjak “wild type” . onda je neophodno retestiranje ukršzanjem tri ženke heterozigotne tretirani hromozom i Basc X hromozom sa mužjacima koji imaju Basc hromozom.17 by Vladimir Cvetković 125 . • Nakon prebrojavanja jedinki konstatuje se: – Da li su prisutni mužjaci “wild type” fenotipa – Koliko ima ostalih jedinki – Odnos mužjaka i ženki u kulturi • Ako u flakonu ima 20 ili više potomaka i među njima nema mužjaka “wild type” fenotipa za tu kulturu se smatra da sadrži letalnu mutaciju i dalja testiranja nisu potrebna.03. U F3 generaciji se ponovo traže mužjaci “wild type” 27.

17 by Vladimir Cvetković 126 . 27. • Kada se konačno rezultati prikupe onda se frekvenca polno vezanih recesivnih letala izračunava na sledeći način: • Broj letala/broj letala + broj neletala = % letala • Test j pozitivan ako se u leglima koja su nastala ukrštanjem tretiranih jedinki test supstancom rezultat značajno razlikuje od rezultata u negativnoj kontroli i obrnuto.03.

17 by Vladimir Cvetković 127 . • Omogućava otkrivanje čitavog spektra genskih alteracija: – Tačkaste mutacije – Male intersticijalne i terminalne delecije – Druge efekte  Za veliki broj mutagena važno je ispitati metaboličku transformaciju što je moguće ispitati u in vivo sistemima. Spot – Test na sisarima • Tvorci testa Russell i saradnici 1957. 27.03.

27.17 by Vladimir Cvetković 128 .03. očekivane boje. • U ovom testu. embrioni koji su u razvoju se izlažu genotoksinima. • Ciljne ćelije su melanoblasti i geni koji kontrolišu pigmentaciju dlaka • Marker mutacionog dogadjaja predstavljaju polja (spotovi ili mrlje) dlaka na telu sa promenjenom bojom u odnosu na ostali. dlačni porivač jedinke.

heterozigota za jedan broj gena za boju dake. • Bitno je napraviti razliku između: – Mrlja nastalih kao posledica mutacije – Mrlje nastale usled citotoksičnosti – Lažne mrlje 27. posle indukcije somatske mutacije in utero. Cilj testa • Osnova testa je detekcija mutantnih klonova pigmentnih ćelija kod mišijih embriona.03.17 by Vladimir Cvetković 129 .

17 by Vladimir Cvetković 130 .26%) – Postoji pozitivna korelacija između vremena tetmana i veličine i učestalosti mrlja • Spontana učestalost: – Vrlo niska 27. Učestalost mrlja • Indukovana učestalost: – Zavisi od mutagena (1% .03.

17 by Vladimir Cvetković 131 .03. • *karakteristike navedenih sojeva videti u knjizi • Miševi odabranih sojeva se uparuju tako što se jedan mužjak i tri ženke u odvajaju u zasebnom kavezu. 27. • Embrioni koji se tretiraju in utero se dobijaju ukrštanjem miševa T i HT soja ili C57B1 i T soja. Protokol testa • Upotrebljavaju se isti genetski zapati miševa koji se odgajaju za test za detekciju specifičnog lokusa tako da je na dlaci miša lako uočljiva fenotipska promena nastala usled mutacionog dogadjaja.

i 11. • Zatim se pristupa administriranju test agensa per os ili intraperitonealno i to u periodu između 8. dana posle začeća.17 by Vladimir Cvetković 132 . • Vaginalni bris ženki se proverava u naredna četiri jutra. 27. • Izbor dana kada treba izvršiti tretman je kritičan zbog broja melanocita koje mutiraju i stepena umnožavanja mutiranih ćelija u toku klonalnog rasta.03. Kada se utvrdi da u brisu postoje spermatozoidi ženka se smatra oplođenom i to vreme se računa kao “0” vreme tretmana.

03.17 by Vladimir Cvetković 133 . • Embrioni koji su heterozigoti dobiju tretman neposredno preko majke. 27. • Ćelije klonovi mutiranog melanoblasta finalno daju polje dlaka odredjene boje koja se razlikuje od ostatka dlačnog pokrivača životinje pa se to uočava kao spot-mrlja kod životinja starih dve nedelje. • Promena ili gubitak divljeg alela na jednom lokusu za boju krzna u melanoblastima (prekursori melanocita) dovodi do ispoljavanja recesivnog alela.

17 by Vladimir Cvetković 134 .03.27.

• Ako se u ukupno izbrojanom potomstvu utvrdi postojanje jedne ili više mrlja.17 by Vladimir Cvetković 135 . • Brojanje i posmatranje mrlja treba da se obavi između treće i četvrte nedelje jer se u kasnijem periodu starosti te mrlje mogu izgubiti. pretpostavlje se da su one uslovljene indukovanom somatskom genskom mutacijom. • Negativnu kontrolu treba tretirati samo rastvaračem a pozitivnu poznatom supstancom koja izaziva kolor mozaik dlake kod miševa. 27.03.

grla.17 by Vladimir Cvetković 136 . dojki.03.• Tumačenje mrlja – Bele mrlje koje su na 5mm od srednje ventralne linije posledica su ubijenih ćelija – Žute aguti mrlje koje su u oblasti genitalija. Mitotski crossing-over) 27. pazuha i sredine čela potiču od pogrešne diferencijacije – Pigmentirane i bele mrlje nasumice raspoređene na dlaci potiču od somatskih mutacija  Mehanizam kojim recesivni gen dolazi do izražaja prilikom dejstva mutagena može da bude genska mutacija ili proces rekombinacije (npr.

17 by Vladimir Cvetković 137 .03. Prednosti i nedostaci testa • Osetljiva metoda za različite mutagene • Pored genetskih mogu se posmatrati i teratogeni efekti • Preciznija ekstrapolacija rezultat na čoveka • Nedostaci: – Veliki broj životinja je neophodan – Supstanca mora da savlada placentalnu barijeru – Skup test – Vrlo često ispitivane supstance negativno deluju na veličiu okota 27.

03. • Abnormalnosti koje se detektuju : – Hromozomski prekidi – Abnormalnosti deobnog vretena. Mikronukleus test • Ovim testom se in vivo detektuju oštećenja hromozoma ili mitotskog aparata u ćelijama sisara usled dejstva hemijskih mutagena. 27.17 by Vladimir Cvetković 138 .

• Zasniva se na posmatranju ekstranuklearnih telašaca u ćelijskoj citoplazmi. • Frekvenca mikronukleusa je korelisana sa hromozomskim aberacijama.03. • Mikronukleusi su ustvari citoplazmatične hromatinske mase sa izgledom malih jedara koji potiču od hromozoma zaostalih u anafazi ili od acentričnih fragmenata 27.17 by Vladimir Cvetković 139 .

neoštećeni hromozomi kao i centrićni fragmenti ulaze u sastav normalnih jedara ćerki ćelija. • Zaostali fragmenti se takođe priključuju ali se pretvaraju u jedno ili više sekundarnih najčešće okruglih jedara koja su po pravilu manja (6-20x) od glavnog jedra pa se nazivaju mikronukleusima. 27.17 by Vladimir Cvetković 140 .03. Mehanizam nastajanja mikronukleusa • U anafazi acentrični hromatidni i hromozomski fragmenti zaostaju dok se centrični elementi kreću ka polovima ćelije. • Posle telofaze.

Vrste ćelija za analizu mikronukleusa • Polihromatski eritrociti iz kostne srži koji predstavljaju novoformirane eritrocite. – Ima ih u velikom broju – Jasno se razlikuju od ostali ćelija na razmazu – Spontana pojava mikronukleusa kod ovih ćelija je veoma retka – Identifikuju se bojenjem rezidualne RNK koja se zadržava u ćeliji još dva dana nakon sazrevanja – glavno jedro je istisnuto što omogućava lakšu vidljivost mikronukleusa 27.17 by Vladimir Cvetković 141 .03.

03. Princip testa • Životinje se izlažu dejstvu supstance najčešće intraperitonealnom administracijom ili per os • Voda kao rastvarač test supstance se najčešće koristi a ako je test supstanca nerastvorna u vodi onda se koristi DMSO.17 by Vladimir Cvetković 142 . • Doza supstance – Maksimalna tolerantna doza (ona koja ne dovodi do smrti životinje) 27.

Eksperimentalne životinje • Mus musculus • Rattus norvegicus • Cricetulus griseus • Kontrolne grupe: – Negativna (tretira se fiziološkim rastvorom npr.03.17 by Vladimir Cvetković 143 .) – Pozitivna (tretira se poznatim mutagenom za koji se pouzdano zna da indukuje mikronukleuse) 27.

– Minimalno vreme kod miševa iznosi 5h • Nakon tretmana sa najvišom dozom – Sledi prvo uzimanje kostne srži posle12h – U roku od naredna 72h slede još dva uzorkovanja 27. Izvodjenje testa • Anuklearni zreli eritriciti sa formiranim mikronukleusima mogu da se formiraju između završetka finalne eritroblastne mitoze i faze enukleacije (faza maturacije – istiskivanje jedra iz ćelije) • Neophodno je znati koliko treba sačekati od momenta tretmana do pojave ovih ćelija koje se posmatraju.03.17 by Vladimir Cvetković 144 .

butne kosti se očiste od mišića sterilnim makazama i skalpelom • Zatim se jedan kraj femura preseče jačim makazama tako da se otvori centralna šupljina u dijafizi kosti. • Sledi centrifugiranje na 1000 obrtaja 27.03.17 by Vladimir Cvetković 145 . • Zatim se u špric navuče serum i iglom su ilazi u šupljinu • Pažljivo se aspirira kostna srž a zatim se više puta pažljivo ispušta i uvlači miks seruma i kostne srži. Uzimanje uzoraka kostne srži • Nakon adekvatnog žrtvovanja životinje.

• Napravi se viskozna suspenzija ćelija i jedna kap se nanese na kraj pločice i razvuče u tankom sloju uz pomoć pokrovnog stakla duž predmetnog stakla. a zatim još dva bojenja u razblaženom May-Gruenwald-u 1:1 sa vodom. • Sledi bojenje Gimzom rastvorenoj u vodi 1:6 • Sledi ispiranje vodom i ksilenom • Nakon ovog postupka bojenja mikronukleusi bi trebali biti jasno uočljivi 27.17 by Vladimir Cvetković 146 .03. • Nakon sušenja na vazduhu razmaz se fiksira u apsolutnom metanolu 2-3minuta. • Sledi bojenje u koncentrovanom May-Gruenwald-u.

27.03.17 by Vladimir Cvetković 147 . Analiza preparata • Učestalost mikronukleusa se određuje u najmanje 1000 ćelija po životinji rpi čemu se broje ćelije koje sadrže mikronukleuse a ne sami mikronukleusi.

17 by Vladimir Cvetković 148 .03. • Ako je test pozitivan to znasči da ispitivana supstanca indukuje lezije na nivou hromozoma ili oštećenja mitotskog aparata ćelije. Procena razultata • Test će biti pozitivan ako test supstanca izazove statistički značajno povećanje mikronukleiranih ćelija i obrnuto. 27.

03. Prednosti i nedostaci testa • Vrlo pogodan za rutinsku toksikološku kontrolu zbog osetljivosti i promena koje detektuje • U posebno važnim slučajevima moguće je da se ispita kostna srž primata i čoveka. 27. • Veliki je broj ćelija koje se posmatraju na preparatu • Relativno jednostavan za sprovođenje • Jedina mana je što se ovim testom ne mogu detektovati mutageni koji ne “lome” hromozome i koji ne prouzrokuju zaostajanje hormozoma u anafazi .17 by Vladimir Cvetković 149 .