UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL-
LABIOEX

Avaliação da viabilidade celular pela
técnica do MTT

Ms. Karina Bettega Felipe

Florianópolis, maio de 2011

1. Princípio

000µg/mL (1%). 3.000u/mL e estreptomicina 10.  Solução de MTT (0.5mg/mL). Amostra  Células aderentes cuja viabilidade celular deseja-se avaliar após o seu tratamento com o composto/extrato em estudo. 2. Reagentes/soluções/suspensão celular  Meio de cultura completo: meio DMEM alto teor de glicose suplementado com soro fetal bovino (10%) e solução de antibióticos penicilina 10.Preparar 10 mL Pesar 5mg de MTT/ Adicionar 1mL de PBS/ Adicionar 9mL de meio de cultura completo .

5X105 células/mL: a) Retirar o meio de cultura da garrafa .5X105 células/mL 4. Suspensão celular na concentração de 0. Procedimento  Preparar uma suspensão celular na concentração de 0.

b) Lavar a garrafa com PBS c) Adicionar a tripsina .

d) Esperar a tripsina reagir e) Preparo do meio de inativação .

f) Inativar a tripsina g) Divisão do conteúdo da garrafa em dois tubos falcon .

h) Centrifugar as células i) Retirar meio com tripsina .

j) Ressuspender as células em meio simples .

k) Contar as células Nº céls/mL= nº céls contadas/4 x diluição da câmara X diluição amostra Nº céls /mL=nº céls contadas/4 x 104 X 10 .

19200µl X= 9.5 X105 células – 1000µl X .5 X105 células por mL -200 µl/ poço X 96 poços = 19.6 X105 células? 5 X105 células – 1000µl 9.6 X105 células .X X= 1920µl .2 mL .6X105 células.Contagem de células: 5 X 105 células/mL -Número de células necessárias: 0.Quantos µl da suspensão celular terá 9.l) Preparar suspensão 0.

X X .19200µl X= 100µl X= 1920 .Precisaremos de 19.5 X105 células .Suspensão utilizada para o teste: .200µl 1920µl de soro 192µl de antibiótico 1920µl da suspensão celular 15168µl de meio .5 X105 células) – 1000µl 0.5 X105 células – 1000µl 100µl (0.

 Preparo da suspensão celular  Adicionar 200µl da suspensão celular em cada poço .

24h Retirar o meio de cultura 24. 48 ou 72 h TRATAMENTO .

25. 6.25.125 µg/mL) 200µL 1000µL 1000µL 1000µL Solução mãe 100µg/mL 50µg/mL 25µg/mL 12.5µg/mL (1000µg/mL) 1800µL meio 1000µL meio 1000µL meio 1000µL meio 1000µL 1000µL 3. 50.125µg/mL 6.Doxorrubicina (100.25µg/mL 1000µL meio 1000µL meio . 3. 12.5.

125 B CTRL 100 50 25 12.5 6.125 C CTRL 100 50 25 12.25 3. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A CTRL 100 50 25 12.5 6.5 6.125 D E F G H .25 3.25 3.

48 ou 72 h TRATAMENTO .24h Retirar o meio de cultura 24.

O que vocês vão fazer!!! Preparar Retirar o Lavar os solução meio poços 2X MTT com PBS Adicionar 5’ DMSO 2h Estabilização da cor 5’ 540 nm .

Solubilizar em 1.5mg/mL) CV=CV 5mg/mL X V = 0.0 mL de PBS estéril. Pesar 5mg de MTT . b) Preparo da solução de uso (0.5mg/mL) a) Preparo da solução estoque a 5mg/mL . Preparo da solução de MTT (0.5mg/mL X 10 mL V= 1mL da solução estoque + 9 mL de meio completo 900µl de soro + 90µl de antibiótico + 8010µl de meio .

O que vocês vão fazer!!! Preparar Retirar o Lavar os solução meio poços 2X MTT com PBS Adicionar 5’ DMSO 2h Estabilização da cor 5’ 540 nm .

 Cálculos Descontar o branco ! Considerar o controle como 100% de Fazer a média da células viáveis e fazer regra de três para absorbância determinar a viabilidade celular das amostras .