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CROMATOGRAF

ÍA DE PARES DE
IONES (IPC)
Integrantes:
Ramírez Pulido Abraham Enrique.
Valencia Mora Ricardo Augusto.

ÍNDICE
INTRODUCCIÓN
EMPAQUE DE COLUMNAS PARA IPC
REPARTO DE FASES
OTRAS VARIABLES DE SEPARACIÓN
PROBLEMAS
DISEÑO DE UNA IPC

2

INTRODUCCIÓN
 Desarrollada por el Dr. Gordon Schill (1973)

 Nace como respuesta a las limitantes de la cromatografía de intercambio iónico:
 Columnas menos eficientes
 Columnas no reproducibles
 Pobre estabilidad
 Opciones limitadas en los empaques disponibles (selectividad limitada)

 ¿Cuándo se necesita usar la cromatografía de pares de iones?
 Reducir el coleo de los picos de analitos muy básicos
 La habilidad de incrementar la retención de ácidos y bases ionizados que son
pobremente retenidos y obtener valor aceptables de k’
 Proveer de una opción adicional para controlar la selectividad en la separación de
muestras iónicas

3

CROMATOGRAFÍA DE PARES DE IONES  Desarrollada para permitir la separación de mezclas complejas de moleculas muy polares e iónicas. sales de tetraalquilamonio R4N+ (R+). Debe de tener una carga opuesta al analito  Se añade para mejorar la forma del pico y el tiempo de retención  Contraiones tipicamente usados: alquilsulfonatos R-SO3.(R-). ácidos carboxílicos fuertes (ácido trifluoroacético (TFA). Se puede usar en analitos cargados tanto positiva como negativamente  Fase móvil  Buffer acuoso (con un cosolvente orgánico añadido en el caso de las separaciones con fases enlazadas)  Contraión  Molécula iónica de gran tamaño. ácido heptafluorobutírico (HBA)) 4 .

los The with cosolventes capacity mobile-phase y la temperatura factor pH andk' isionic related to E as follows: strength.between the two phases: organic stationary phase. In this case we can write Eq. RETENCIÓN organic stationary phase. In this case we can write Eq. respectively. concentration and kind of organic co-solvents in the mobile phase (e.2) where E is a constant for a particular IPC system but varies with mobile-phase  Donde EpH esanduna constante ionic para un sistema strength. 11. 8.g. la IPC concentración or methanol).1 for distribution of sample R. particular and but system variesde temperature. respectively. en términos de las The extractionde concentraciones constant E is next defined las especies in terms of the concentrations ( ) of the involucradas: preceding species: (11. increases the utility Bonded-phase of a single columns columnliquid (no organic by allowing added asrapid interchange stationary phase)becan tween two LCconverted be quickly methods. concentration and kind en particular of organic que invaría co-solvents the con el pH y fuerza iónica mobile where E is ade phase la acetonitrile (e. The capacity 5 factor k' is related to E as follows: .between the two phases:  La distribución de la muestra entre las dos fases se describe de la siguiente (11.1) The subscripts aq and org refer to aqueous and organic phases.. 11.1 for distribution of sample R.1) forma: (11. for reverse-phase partition LC. fase constant for amóvil. The extraction constant E is next defined in terms of the concentrations ( ) of the preceding  La constante de species: The subscripts aq and org extracción E refer to aqueous se puede and organic definir phases.. and vice versa.g. acetonitrile or methanol).2) (11. and temperature. this increases the utility of a single column by allowing rapid interchange be tween two LC methods.

2 Column Packings concentración del contraión TBA + 457 (11.5) is related to E as La variacón de la concentración del contraión provee una forma de E = K/(TBA ).-1) are predicted to be proportional to the concentration of the counter-ion TBA+. RETENCIÓN  El factor de retención (K’) de todos los compuestos de una muestra son proporcionales a la 11. Note +  that the distribution coefficient K (eq.2a) Thus. 2. the k' values of all sample compounds (of unit negative charge.la shows a typical ap- . + The variation controlar of (TBA la fuerza )aq provides del disolvente. Figure 1l. a way of controlling manteniendo solvent mas una selectividad strength o 6 menos while constante holding selectivity more or less constant.

UV. 2. same except counter-ion concentration is 4 7 times larger (0. nicotinic acid.03 M tetra- butylammonium NaSO4 (counter-ion) plus 0.32 cm. Column. silizanized LiChrosorb SI-60 (10 µm) with 1-pentanol as stationary phase. isonicotinic acid.12 M). (b) Mobile phase.1 Reverse-phase IPC separation of pyridine derivatives with 1-pentanol as sta- tionary phase. 4. 3. 0. ∆ P = 1000 psi. 20 × 0.Figure 11. (a) Mobile phase. 254 nm.8 ml/min. . (a) 1. 0. 55-µl serum sample plus 50-ng nicotinic acid.04 M phosphate (pH 7.4) in water. (b) Assay for nicotinic acid in serum. Reprinted from (11) with permission. 25°C. 5-fluoropyridine-3-carboxylic acid. 5-fluoro-3-hydroxymethyl pyridine. 90-220 ng each compound injected.

(fase estacionaria) 8 .  El analito interactúa primero con el contraión en la fase móvil  Se forma un par iónico relativamente no polar que interactua repartiéndose en la fase estacionaria y se retiene R+A. MECANISMOS DE RETENCIÓN  Modelo de reparto:  En este modelo. el contraión esta presente en la fase móvil.(fase móvil) R+A.

E.(fase móvil) + R+X.) + X- 9 .(fase estacionaria) A -R+ (F. MECANISMOS DE RETENCIÓN  Modelo de adsorción:  El contraión presente en la fase móvil se adsorbe en la fase estacionaria no polar debido a la interacción con su cadena alquílica hidrofóbica. forma un par iónico y se retiene A.  El contraión forma una pseudo capa de intercambio iónico sobre la superficie de la fase estacionaria  El analito interactua con el contraión presente en la superficie.

VENTAJAS DE LA OPERACIÓN NP-IPC Y RP-IPC FASE NORMAL FASE REVERSA  Puede usar contraiones con propiedades flurescentes No requiere de fases estacionarias retenidas o absorbentes para facilitar la deteccion de analitos mecanicamente que no poseen dichas características  No hay “sangrado” del contraión desde la fase  Es fácil variar la selectividad mediante la variación de estacionaria la composición de la fase móvil  Las muestras acuosas pueden ser inyectadas directamente  Gradiente de elución (variación del contraión en fase móvil o polaridad del disolvente con columnas de fase enlazada)  Las muestras biológicas requieren de una menor preparación antes de la inyección  Fácil variación de la fuerza del disolvente mediante un cambio de pH en la fase móvil 10 .

)] 11 . péptidos. aminoácidos con IPR fluorados. aniones inorgánicos en compuestos farmacéuticos. EMPAQUE DE COLUMNAS PARA IPC  IPC en fase reversa  Tamaños de partículas porosas (5-10�m)  Se preparan de la misma forma que las columnas de BPC  Rango de pH (1-13)  Más comunes C18 y C8  C4 (elución gradiente de aminoácidos)  Adsorbentes poliméricos fluorados (ADN plasmídico)  Carbono poroso grafitizado (PGC) [quiral (enantioseparar aminoalcoholes. etc.

 pH 3.  Empaques de partición de fase inversa. . pH (Butil)4N+  Colorantes 2-4  Cromatografía de “jabón” SAS-sílice  Agua/propanol y/o (Hexadecil)(CH3)3N+  Ácidos sulfónicos CH2Cl2 ODS-sílice  Agua/metanol/H2SO  (Dodecil)SO3.05M HClO4  (Octil)3NH+  Ácidos carboxílicos. sulfonatos Agua más amortiguador.1M HClO4/agua   ClO4.4  (Butil)4N+  Ácidos Carboxílicos  µ-Bondapak C18  Metanol/ agua. sulfonatos Intercambiadores de iones Ácido bis-(2.  Fenoles líquidos  etilhexil)fosfórico/ CHCl3 etilhexil)fosfato  Tri-n-octilamina  0.4  (Butil)4N+  Ácidos orgánica carboxílicos. SISTEMAS DE CROMATOGRAFÍA DE PARES IÓNICOS DE FASE INVERSA.  Aminas /acetonitrilo LiChrosorb RP-2  pH 7. Aminas  4  Fase estacionaria 1-Pentanol   pH 7. Fase Estacionaria Fase móvil Contraión Muestras  Fases enlazadas ODS. utilizados sin fase orgánica estacionaria 12 añadida.sílice 0.8 Bis-(2. a menos que se indique lo contrario.

30  2. 25 2. Longitud de la Nombre  Forma Funcionalidad   Materia Tamaño Longitud Diámetro  Descripción cadena   l de de de la interno de la base partícul columna columna a (Mm) (cm)  (mm)  MicroPak CH  B o C  Octadecilsilano  LiChrosor 10   25. C  b . 10      Monocapa. estable a pH 1-9. pH máximo de 8.2-4  Capa polimérica. 4. monofuncional. 4  8% Carbono     B o C Octadecilsilano LiChrosor 10  30 3.6  Para compuestos polares.2  10% de carga  Larga    C  Octadecilsilano Vydac 10      10% de carga TP     B o C  Octadecilsilano  LiChroso 5. 4. 10   25.ODS B o C  Octadecilsilano  Zorbax 6  15. 8% de carga  b    C Octadecilsilano juPorasil 10  25 3.6  Fase inversa de utilidad general    Zorbax. 22% de carga  b  Partisil ODS-2 C  Octadecilsilano  Partisil   10  25 4.2. 30 4. ALGUNOS EMPAQUETADOS MICROPARTICULADOS DE BPC PARA IPC EN FASE INVERSA. 22% de carga rb  Hypersil-ODS          25 3  Esférica. estable en pH 1-9.30 2.9  Capa monomérica. 4. monofuncional Sil   Nucleosil C-18 B o C  Octadecilsilano  Nucleosil 5. 10   25 4.4.6  El doble de capacidad esférica que C-8    Hi-Eff Micropart C-18 C  Octadecilsilano  Hi-Eff  5  25 5  Columnas pre-ensayadas     B Octadecilsilano Hypersil 5-7  25.6 C18.6  5% de carga  rb  MBondaPak C18 Vydac C  Octadecilsilano  Partisil  10  25     LiChrosorb RP-18             Forma irregular Spherisorb ODS                Partisil ODS-1                ODS-Sil-X-1               LiChrosorb RP-8 BoC Octilsilano   LiChroso 5. 10 25 2. 10   25 3  Monocapa.C8 C Octilsilano   Zorbax 6   15. 5% de carga MicroPak MCH B o C  Octadecilsilano  Spheriso 5. C2. Intermedia Sil esférica  13 Chromegabond C8 C  Octasilano  LiChrosor 10   30 4.4.6  22% de carga. 15% de carga. 13-14% de carga  rb  Nucleosil C-8 B o C  Octilsilano   Nucleosil 5. 25  2.4.6  16% de carga   Zorbax.

EMPAQUE DE COLUMNAS PARA IPC  IPC en fase normal  Solución acuosa de amortiguador más contra-ión retenidas mecánicamente en un soporte de sílice poroso. etc. tierras de diatomeas.  Técnicas de empacado:  1) Evaporación de disolvente (X)  2) Recubrimiento in situ (√)  3) Recubrimiento de equilibrio (√) 14 .

EVAPORACIÓN DE DISOLVENTE Soporte seco Soportes sólido en un plato de de 20�m evaporación Exceso de Eliminación de disolvente disolvente en volátil con fase un evaporador estacionaria rotatorio Evaporación *Agitación suave lenta bajo una Calentamiento por Polvo seco corriente de lámpara de infrarrojo nitrógeno* 15 .

RECUBRIMIENTO IN SITU (η < 2cP) Fase Mezclas de (I) Columna estacionaria agua. 2. etanol y eluye de la 2. 4- seca pre- trimelpentano empaquetada columna (completo) Inyección de A través de la Bombeo de Volúmenes columna fase movil sucesivos de (desplazar el saturada fase aire) estacionaria (II) Fase móvil (pre- (II) Bombeo de fase estacionaria equilibrada) para eliminar 16 exceso de fase estacionaria .

Eliminación y (20-40%) los poros del recubrimiento soporte Hasta alcanzar Bombeo de Bombeo de un Inmiscible con el equilibrio mezcla a través segundo la fase (lectura de la columna disolventre estacionaria constante del detector) Miscible con la primera fase móvil 17 .η ++ = horas En un buen Se disuelve la la fase .++ caudal fase estacionaria concentración .Poro > 500Å disolvente a alta estacionaria en . RECUBRIMIENTO IN SITU (η ≥ 2cP) Precipitación de .

RECUBRIMIENTO DE EQUILIBRIO Columna seca pre- empaquetada Fase móvil  Modificación del método in saturada con Eliminación de situ fase fase móvil estacionaria Formación de Se bombea a capa de través de la equilibrio (fase columna estacionaria) 18 .

CONSIDERACIONES  Pre-columna (√)  Termostato (√)  Poros anchos (X)  Criterios de CLL (√)  Soportes inertes (√)  Soporte de alta superfice-cargas bajas (X)  Poros (200-500 Å) (√)  Sílice y tierras de diatomeas (√) 19 .

1-2. 30  5  3g de Sílice en columna de 30cm ICN sílice  B  3-7.4.9 3000 placas/columna a 1.5 µm de distribución 20. Hypersil   B  5-7 200      Metanol extraído y activado.6  Densidad de empaquetado 0.6 de 50cm disponibles para 10 µm   µPorasil  C  10 300-350  30  3. 35 A°.10  5. 25.8 y 1 ml/g.3 cm/s   RSL sílice  B o C  5.1-4.2  Tamaño de poro 330 A°  C-column  Zorbax Sil  B o C  6 350  15.9 g/mL 20 irregular LiChrosorb ALOX  B o C  5. 60D tiene distribución  Sil 60  B o C  5.6  Poro 60 A°. volumen de poro 1. volumen de poro 0.5  30  Chromasep PAA  B o C  5.78mL/g Diámetro de poro promedio 95 A°.2. 30    Contiene LiChrosorb Si60 HiEff Micro Part   C  5. 10 500  25. 10. Chromegasorb  C 10  500  30   4. LiChrosorb Si-60   B o C  5.  Tamaño de Área de Diámet Longitu Tipo  Nombre   Forma partícula superfici ro Descripción  d (cm)  promedi e (m2/g)  (mm)  o (µm) BioSil A   B 2-10   400     Metanol extraído y activado.10  370 25 2.  Nucleosil SO  B o C  5. columnas  Partisil  B o C  5. 0. 10 70  25-30  2. pH básico de 9. densidad 0. 10 500  25. B. 25  2. contiene LiChrosorb Si  Columnas preparativas disponibles de tamaño de poro: 50 A°. 10 400  15. tamaño de poro 80 A°. 25. 7-12   200  25    5    Columnas pre-ensayadas Neutral.  Spherisorb SW  B o C  5. 10 380      860 m2/g.75ml/g.  LiChrospher Si-  B o C  5.6 Tamaño de poro 60 A°.6  Poros de 57 A°.6  Columna llena con Li-Chrosorb 60R Chrom Sep SL  B o C  5. 10. 30  2. XOA 1000 es  B  5-8 550      600  Super Microbead  B  5. 4.0 Tamaño de poro 60 A°. 20  500  4.6 g/mL.bulk Si  Vydac TP Ads. 30   2. volumen de 0.6  Diámetro de poro 150 A°  . 25. 7-12 500-600       Tamaño de poro: 60 A°  Sílice. 20 60  4.1.  B o C  10 100  25  3. 10 220  4. 100 A° irregular  MicroPak Si  B o C  5. 10 400+  25  4. hierro-libre ±1. 30    Empaquetado con LiChrosorb Alox T   Alúmina HiEff Micropart Al ICN Al-N  C  B  5. 20. 10 25 4. ALOX 60D     5. 10  3-7.8 mL/g 20.6 30 amplia.10 500  4  Volumen de poro 0. máximo pH 8   Sílice esférico 25   Spherosil XOA Diámetro de poro promedio 83 A°. 10 250  15. 4.6  Tamaño de poro 70 A°. tamaño de poro 50 y 100 A° 30  10. Tamaño de poro 60 A°.4.2mL/g.6  Tamaño de poro 100 A°  100 20.ALGUNOS EMPAQUES MICROPARTICULADOS Y COLUMNAS PREENVASADAS PARA LSC Y LLC. 10 70 15.

Aminas  de etilo.1M HClO4  ClO4.3  (Butil)4N+ CH2Cl2/hexano carboxílicos  CH2Cl2 Glucurónidos y (Etil)4N+.  Butanol/CH2Cl2/hexa Ácidos  (Butil)4N+ amortiguador no carboxílicos   CH2Cl2 . 21 Contraiones colorados para la detección de compuestos no absorbentes.5  Butanol/heptano  (Butil)4N +  Sulfonamidas  Aminas y  Butanol/ compuestos de  0. CH2Cl2.  HPO42-/PO43. acetato 0. .  Aminas butanol y/o pentanol  pH 5-6  CH2Cl2 y/o CHCl3  Picrato Aminas   pH 6-8. (Butil)4N+.1M Ácido  Butanol/  CH3SO3. pH 7. Fase estacionaria Fase móvil Contraión Muestras  Ciclohexano/ CHCl3/  Ácidos pH 9.1M HClO4  ClO4.  0.SISTEMAS DE CROMATOGRAFÍA DE PARES IÓNICOS DE FASE NORMAL. butanol.2-0.0  N-metilamitriptilina 1-pentanol carboxílicos  Diferentes mezclas de fosfato.25M HClO4  ClO4- CH2Cl2/hexano amonio cuaternario  0.CHCl3.4 /CHCl3/butanol y/o conjugados de (Pentil)4N+ pentanol sulfato Agua amortiguada por diferentes sales o contraiones. Aminas  metanosulfónico CH2Cl2/hexano  Butanol/ Ácidos  pH 8. y/o hexano.

REPARTO DE FASES  Consideraciones generales para los sistemas de cromatografía de pares de iones  1. Ajuste de temperatura. El sistema tiene que ser físicamente estable: cualquier fase mayormente orgánica debe ser inmiscible con la fase mayormente acuosa. fase estacionaria y/o fase móvil)  3. Evitar el coleo de los picos: prueba y error con sistemas IPC (variar contraión. proceso dentro de la capacidad lineal de la columna 22 . No variar los valores de K’ por una variación en la concentración del analito: uso adecuado de buffer. No perder la fase estacionaria en el caso de NP-IPC  2.

reloading the column). respectively. respectively.3 Partitioning Phases  Para los sistemas 463 en fase reversa: (11. k' can be varied by changing the concentration of counter-ion in the stationary phase. However. k' changes as (C+)2 or (C+)3.e. Thus.3 and 1l. this is less convenient.3) ll. in- FE y E es constante si las demás creasing the concentration of the condiciones no mobile counter-ion in the cambian phase causes an increase in k' for reverse-phase IPC (and a decrease in normal-phase IPC). because it 23 means changing the stationary phase (i.. In either . and E is constant if other conditions are unchanged. PAPEL DEL CONTRA-IÓN  Cambia fácilmente la fuerza del disolvente al variar el tipo de contraión o su concentración 11. For bi- valent or trivalent sample ions.3a apply for the case of singly ionized sample ions. Equa- tions 11. In normal-phase IPC.3a Here (C+) and (C-) refer to the concentration of a cationic or an anionic counter- (C ) y (C ) se + - refiere a la concentración del contraión aniónico o catiónico en ion.

PAPEL DEL CONTRAIÓN  K’ puede variar tanto en NP como en RP al variar el tipo de contraión  No conveniente en el caso de NP. ya que significaría cambiar la FE y volver a cargar la columna  La adición de un grupo –CH2.5.a la molécula del contraión cambia K’ por un factor de 2. ↑ cadena alquílica ↑ K’ en RP  Variación de la concentración: 24 .

5) plus counter-ion (TBA+) and Na2SO4 in water. UV. 25 × 0. Reprinted from (8) with permission. 25-50%v butanol/heptane mixtures.25 M borate (pH 8.total  13 . mobile phase.nula Figure 11.parcial  14 .5-5.2a Selectivity changes as the concentration of counter-ion is varied to change k' values. 27°C. Column. 9. Sulfonamide separations by normal-phase IPC.0%w 0. 254 nm. 25 .1-0. 12 .32 cm LiChrospher SI- 100 (10 µm) coated with 1. Variación de la concentración del contraión:  El efecto en la selectividad de la separación es mayor a medida que la ionización de la muestra disminuye  Ionización:  6.

2a. Other conditions as in Figure 11. ↑fuerza del disolvente.2b Selectivity changes as the polar mobile phase component is varied to 26 change k' values. ↓K’ Figure11. POLARIDAD DEL DISOLVENTE  La variación de esta condición cambia la fuerza del disolvente  Los cambios en la selectividad de la separación son menores cuando se hacen mediante el cambio de las concentraciones relativas de una mezcla de 2 componentes  En sistemas en fase reversa sin la adición de una fase estacionaria orgánica suele usarse una mezcla de agua con MeOH o ACN  ↓%H2O. .

2a.9 5 . Table 11.3 1 -B u ta n o l 3 .3 forma exacta.6  Se observa una mejor predicción tomando C H 2C 1 2 3 . B enzene 3 .25ε parámetros P’ antes vistos no aplican de C C 14 1 . Other conditions as in Figure 11.2b Selectivity changes as the polar mobile phase component is varied to change k' values.5 8 .1 6 .9 1 7 .0 2 .3 6 .6 C H C 13 4 .5 1 3 .8 disolvente 1 -P e n ta n o l 3 .3 Source: Data from (1.5 Solvent strength in normal-phase ion-pair chromatography.8 5 . FUERZA DEL DISOLVENTE EN IPC Figure11.6 E th y l a c e ta te 4 .4 4 .0 5 . 466 27 .3 3 .2 2 .8 en cuenta la constante dieléctrica del M e th y lis o b u ty l k e to n e 3 .6 1 4 . por lo que los Solvent P' ε P'+0.4 8 . solvents listed in increasing strength.  Se refiere a la capacidad de disolver o estabilizar las moléculas.4).7 7 .7 2 .

↓K’ en RP-IPC 28 . IONES SECUNDARIOS  Elevar la fuerza iónica de la fase acuosa incremente la concentración del contraión pero también reduce la formación de los pares iónicos. como resultado de una competencia de iones secundarios por formar un par iónico con el contraión  ↑fuerza iónica.

and C are for compounds with pKa values equal to 2. (a) Reverse-phase and (b) normal-phase. 4. and 6. respectively.1). we can predict how the relative retention of each compound will vary with pH . podemos predecir como varía la retención relativa con el pH  Se suele evitar el uso de ácidos o bases débiles como contraiones  Se suele trabajar a valores de pH menores a 8.3 Variation of relative k' values with pH in IPC of anions.468 EFECTOS DEL PH Ion-Pair Chromatography  La variación del pH cambia la selectividad de la separación y no suele usarse como medida de variación de la fuerza iónica del disolvente  Si conocemos los valores de pKa de los ácidos o bases a separar. k'max refers to maximum (constant) value of k' for fully ionized sample molecules. Curves A.5- 9 Figure 11. B. 29 know the pKa values of the acids or bases we are separating (see Table 10.

4 Selectivity changes with change in mobile-phase composition for normal-phase IPC.and the rules of Sections 6.3 apply equally.5 and 7.9 M NaClO4 in water as stationary phase. mixtures of different solvents can each be adjusted for the right solvent strength. where k' values for four catechol amines are shown for three different mobile phases (normal phase IPC system): butanol/hexane (II). and the use of polar solvents from different selectivity groups should provide maximum SELECTIVIDAD DEL changes in selectivity.1 M HC1O4/0. Separation of catechol amines with 0. Data of (3).4. 30 . Thus. An example [data from (3)] is shown in Figure 11. ethyl acetate/hexane DISOLVENTE  Los cambios en la selectividad proceden como en el caso de reparto en cromatografía de líquidos que ya se ha visto  Se pueden ajustar diferentes mezclas de disolventes para obtener la fuerza del disolvente adecuada Figure 11.

= cambia k´ (factor de hasta 2.preformado   (basado en el Vp) No tan grande como para ampliar las bandas de interés 2) Tamaño Vw= Volumen máximo de muestra de muestra Lo suficientemente pequeña para no afectar Vp = volumen de la banda k´ y no se pierda eficiencia significativa de la 31 Vs = volumen de muestra inyectada columna .5 veces [mayor efecto a bajas concentraciones]) ↑ Tamaño máximo de muestra = ↑[contraión]=afecta k´ IPC-RP .Adición de –CH2. ↑ k´ (IPC-RP) y ↓ k´ (IPC-NP) del contraión Cambiando la concentración del contraión en fase Iones de muestra bivalentes o trivalentes estacionaria (IPC-NP) = implica cambiar fase estacionaria (recargar) = cambia k´ Cambiar tipo de contraión = cambia k´(IPC-RP y IPC- NP) . OTRAS VARIABLES DE SEPARACIÓN Intervalo óptimo 2 ≤ k´ ≤ 5 (2 componentes) o 0.Moléculas grandes = ↑ k´ (IPC-RP) y ↓ k´ (IPC-NP) .5 ≤ k´ ≤ 20 (muestras multicomponentes) 1) ↑Concentración del contraión en fase movil = E   Concentración (constante).

Fases estacionaria Columna termostática 3) mecánicamente Temperatura fijas Fases móviles viscosas Separación a temperaturas elevadas Optimizar selectividad de separación 4) Contraiones Sin derivatización Muestras como adsorbentes de pares de iones UV Requiere detectables (IPC-NP) insolubles en fase de lo contrario orgánica Abdorbancia de línea base demasiado alta para la detección de bajas concentraciones 32 .

y a sus condiciones de uso. tampón inadecuado (fase acuosa)  (i) Cromatografía de jabón (moléculas muy polares y carga multiple)  Cola reducida en fases estacionarias de cadena larga (octadecilo) 33 .  (i) Preformar los pares de iones-muestra  IPC-RP sin añadir fase orgánica estacionaria-columna menos estable(depende el uso)  Coleo por disociación de los pares de iones en fase orgánica. PROBLEMAS  Inestabilidad de la columna (fuerzas de cizallamiento). porque los compuestos de la muestra abandonan la columna como pares de iones.  (i) Técnica de revestimiento equilibrado  (ii) Uso de fases pre-equilibradas.  Insuficiente consideración en la selección de pares de iones añadidos a las fases móviles. cuidadoso termotratamiento de columna  Tiempo de vida de columnas (mecánicamente retenidas) corta (↑ tamaños partículas y ↑caudales).  Las columnas de fase normal perderán gradualmente el contraión de la fase estacionaria.

APLICACIONES 34 .

Separación de ácidos (pH de 7-9) y bases (pH de 1-6). heptano-sulfónico o con perclorato) y. DISEÑO DE UNA IPC .No se utiliza mucho para separaciones preparativas (difícil recuperación de los componentes separados de la fase móvil [pares de iones y tampón]) . . cationes). . bases. móvil . ácidos. aniones. uso de mezclas de agua / disolventes orgánicos con adición de sales de contra- iones. tampón y (a veces) neutras. . . .IPC-NP (soporte de sílice poroso 5-10�m [LiChrosorb SI 100]) . los aniones y 35 ácidos con iones catiónicos (tetraalquilamonio [TBA]).Mejor contraión y el pH dependen del tipo de muestra a separar (es decir.Los aniones y cationes de la muestra que son ionizados  Selección de la la fase independientemente del pH no requieren un tampón.Ajuste del pH de la fase móvil varía la selectividad de la separación y mejorar los valores individuales.IPC-RP (sin fase orgánica estacionaria añadida).Si no hay razón específica debe utilizarse IPC-RP (5-1 0�m de una fase unida a alquilo [C18])  Selección de la columna .Cationes y bases se separan con iones aniónicos (ácido pentano.

[detergentes] (1% en peso  Incremento de  Aniones de  Incrementaa  Gran efecto de contraión).[tampón] (0.5-1 M)  Contraiones Cambia  Pequeño efecto .[contraión] (0.  Muestra Decrementaa   Gran efecto Incremento de Cambio de Decrementaa Pequeño efectob solvente orgánico concentración   Solvente Cambia Cambio  orgánico   Temperatura Incrementaa Gran efecto a En IPC de fase normal los efectos se invierten. RESUMEN DE LOS EFECTOS DE LA FASE MÓVIL EN CROMATOGRAFÍA DE PAR IÓNICO DE FASE INVERSA.5 M).001-0.005-0. .05 M). b Efecto mayor para moléculas de muestra parcialmente ionizadas.[perclorato] (0. 36 . Variable Efecto   Efecto sobre la sobre k´ selectividad del solvente  Incremento de Cambio de Incrementaa  Ningún efectob contraiones concentración  . pH muestra .

 Temperatura . . .La adición de la muestra como el par de iones preformados  Tamaño de aumenta el tamaño máximo permisible de muestra. .IPC-RP (sin fase orgánica estacionaria añadida) se benefician a temperaturas aumentadas (50-70ºC).Cambio de la selectividad de separación en IPC con un cambio relativamente pequeño en la temperatura de separación. muestra .Volúmenes de muestra (rango de 25-250 μL) 37 .Temperatura ambiente.

Por lo tanto. la pureza de cualquier tipo de aditivos de eluyente influirá en el rendimiento y la precisión. 38 . CONCLUSIONES  El IPC es una técnica establecida y confiable que proporciona:  Reducción de los tiempos de separación  Resultados muy reproducibles  Formas de pico más agudas  Separación simultánea de analitos ionizados y no ionizados  Amplia selección de aditivos para mejorar la separación Cuanto más modernos sean los instrumentos más sensibles y más fácil será detectar cualquier impureza añadida por los auxiliares además de los analitos de interés.

org/d7e1/7200f089605fd1ab0f9955deb8e2dc293419.shimadzu. (2016).pdf  http://www. Bob W.html 39 . “Ion Pairinf Chromatography”. R.com/an/hplc/support/lib/lctalk/27/27lab. (2008). “Characterization of synthetic dyes by comprehensive two-dimensional liquid chromatography combining ion- exchange chromatography and fast ion-pair reversed-phase chromatography”.J. Rojas Jaime.20. Journal of Chromatography A. Revista Colombiana “Determinación de bases orgánicas mediante la formación y extracción de pares ionicos”de Ciencias Quimico- Farmaceuticas No. et al.  H. Critical Reviews in Analytical Chemistry.  https:// pdfs. 141-146. 1436. 38:161–213.  Cecchi Teresa. Snyder (1979).semanticscholar. “Introduction to Modern Liquid Chromatography”.  Pirok.. REFERENCIAS  L. A Wiley-Interscience Publication. Second Edition.

Journal of Chromatography B. (2017). 1-40 9. . Jingduan et al. “Quantitation of levodopa and carbidopa in rat plasma by LC-MS/MS: The key role of ion pairing reversed-phase chromatography”. CUANTIFICACIÓN DE LEVODOPA Y CARBIDOPA EN PLASMA DE RATA POR LC-MS/MS: EL PAPEL CRUCIAL DE LA CROMATOGRAFÍA DE PARES DE IONES EN FASE REVERSA  Q. Ricardo Augusto Valencia Mora Chi. 1054.

con ácido perfluoropentanoico como contraión y su comparación del resultado con cromatografía de líquidos en fase reversa. OBJETIVO Determinación simultánea de levodopa y carbidopa en plasma de rata usando la técnica de cromatografía de pares de iones. 41 .

INTRODUCCIÓN  Fármacos usados en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson  Levodopa actua como activador de los receptores de dopamina del SNC  Carbidopa reduce los efectos secundarios  Ambos compuestos son sumamente polares 42 .

CONTRAIÓN  Ácido perfluoropentanoico  Pka 0.43  PM 364  Soluble en agua 43 .

154 carbidopa  Columna Zorbax SB-AQ. M/Z: 152 levodopa.MATERIALES Y EQUIPOS  Detección: Espectrómetro de masas AB Sciex API6500 con triple cuadrupolo (spray de iones Turbo V en modo positivo).  Tiempo de análisis: 3 minutos 44 .

PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES  Se uso un buffer de amonio y dos fases móviles en diferentes proporciones  Buffer: 1 M formato de amonio  Fase móvil A: agua/1M formato de amonio/ácido fórmico/PFPA (1000:10:5:1 v/v/v/v)  Fase móvil B: 100% ACN  Stock de levodopa y carbidopa: 200µg/mL en 1%metabisulfito de sodio en agua 45 .

TÉCNICAS USADAS  Cromatografía de pares de iones en fase reversa  Cromatografía de líquidos en fase reversa 46 .

8 mL/min  Levodopa eluyó entre varios picos de interferencia. dificultando su cuantificación 47 . RESULTADOS  Columna Zorbax SB-AQ  4% fase móvil  Flujo: 0.

 Se añadió PFPA como contraión en el extracto de plasma de rata  Columna Agilent Zorbax SB-AQ  4% FM B  FM A: agua/1M formato de amonio/ácido fórmico (1000:10:5 v/v/v)  Formación de par iónico levodopa y PFPA 48 .

 PFPA en fase móvil 49 .

CARACTERIZACIÓN DE COLORANTES
SINTÉTICOS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA
LÍQUIDA BIDIMENSIONAL COMPLETA QUE
COMBINA CROMATOGRAFÍA DE
INTERCAMBIO IÓNICO Y
CROMATOGRAFÍA DE FASE INVERSA DE
PARES DE IONES RÁPIDOS
Q.I. ABRAHAM ENRIQUE RAMÍREZ PULIDO

Pirok, Bob W.J. et al. (2016). “Characterization of synthetic dyes by comprehensive two-dimensional
liquid chromatography combining ion-exchange chromatography and fast ion-pair reversed- 50
phase chromatography”. Journal of Chromatography A, 1436; 141-146.

51

OBJETIVO

Separación de un mezcla altamente
compleja de colorantes sintéticos
utilizando cromatografía líquida
bidimensional con gradiente de elución
en ambas dimensiones.

52

Gran número de colorante INTRODUCCIÓN .Compuestos .Caracterización: .Inestabilidad química ANTRACENO Contenido de muestra: .Productos de degradación FENANTRENO 10-20 muestras diferentes 10-20 compuestos (tintes) Mauveine PIRENO (1856) Solubles en agua Clarificación Ácido Directo Básico Mordiente (catiónicos (cromo) (sustantivo (aniónicos) ) s) 53 .Impureza de colorante (brillantes) .Colorantes diferentes .

Selectividad .No volátil .Gran sensibilidad .Concentraciones divergentes de los compuestos (rango dinámico y efecto de .Colorantes = solubles y/o extraíbles .Complejidad .Polaridades.Capacidades de picos limitada 54 .Estabilidad limitada . . volatilidad (T) y concentraciones (≠) Método analítico (HPLC) Espectrometrí Diodos Espectrometrí Gran sensibilidad a Ultravioleta a de masas -. Información estructural (UV) (DAD) (MS) .

Aumentar resolución y nc .Separación parcial .IPC-RP con gradiente 0 0 nc2=10 nc2=10 ORTOGONALIDAD 0 0     55 .IEC-Fuerte con gradiente nc1=10 nc1=10 .  CROMATOGRAFIA LÍQUIDA MULTIDIMENCIONAL (CL X CL)  Capacidades de picos (nc) = mayor resolución y fiabilidad Acopladas de Columnas de modo Acopladas en Columnas de idénticas idénticas multidimension serie características características al Primera dimensión: Segunda dimensión: .

Amsterdam. Países Bajos). 56 .Muestra METODOLOGÍA Solución de Solución de Combinación de todos los 5000 ppm 100 �L colorantes (c/colorante) (c/solución) (100 ppm) Agua/metanol 1:1(v/v) 54 muestras de colorantes auténticos del período 1850-1920 se obtuvieron de la colección de referencia de la Agencia de Patrimonio Cultural de los Países Bajos (RCE.

 Flujo se ajustó a 0. partículas de 8 �m.5 mL /min. tamaño de poro de 1000 Å) (largos tiempos de equilibrio).0 min. se usó una columna Agilent PL-SAX (PL1951- 3802. gradiente lineal hasta 100% A.5-15. Mantenido a 100% de B durante 4 min. Mantenido a 100% de A durante 1 min. gradiente lineal hasta 100% de B..  La fase móvil A consistió en agua / acetonitrilo 1: 1 (v/v)  La fase móvil B consistió en 100 mM de sulfato de amonio en agua / acetonitrilo 1: 1 (v/v)  Temperatura de 25 ºC  Volumen de inyección fue de 1.5 – 10.1 mm i. 14.5 min.  La bomba binaria se ajustó al modo de elución con gradiente con un programa de tiempo de 16 min: 0 a 0.0 �L.d. 57 .5 min. 150 x 2. MÉTODO (IEC)  Cromatografía de intercambio aniónico. 0. isocrático al 100% de A.

13. mantenido a 100% de B durante 0.0 �L.0 con ácido fórmico. 0.  La bomba binaria se ajustó al modo de elución con gradiente con un programa de tiempo de 15 min: 0 – 0.5 min.  La fase móvil A consistió en tampón / acetonitrilo 95: 5 (v/v)  La fase móvil B consistió en acetonitrilo / tampón 95: 5 (v/v)  Temperatura de 25 ºC  Volumen de inyección fue de 1. columna utilizada Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 de Resolución Rápida HT (959941-902.8 �m). llevados a pH 3.0 mL /min. gradiente lineal hasta 100% de A. partículas de 1. MÉTODO (IPC-RP)  Cromatografía en fase inversa (pares de iones). gradiente lineal hasta 100% de B.5 – 12.  Flujo se ajustó a 1.5 min.6 mm.  El tampón consistió en 10 mM de TMA o TBA en agua. TMA (tetrametil amonio) 58 .0 min.0 a 15. 50 x 4. isocrático al 100% de A.5 min.

gradiente lineal hasta 100% A.6 min. gradiente lineal de 100% A a 100% B. 59 .  La bomba binaria se ajustó para ejecutar un programa de gradiente: 0 a 1.  Flujo se ajustó a 10 �L /min.5 a 1. gradiente lineal hasta 100% A.  La bomba binaria se ajustó al modo de elución con gradiente con el siguiente programa de tiempo: 0 a 10 min.  SEGUNDA DIMENSIÓN  IPC-RP columna utilizada Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 de Resolución Rápida HT  Flujo se ajustó a 2. 10 a 190 min. 190-200 min.5 min. gradiente lineal hasta 100% B.4 mL /min. isocrático a 100% A. MÉTODO (EIC×IPC-RP)  PRIMERA DIMENSIÓN  EIC columna utilizada Agilent PL-SAX  Volumen de inyección fue de 20 �L.4 min. Mantenido a 100% A durante 0. Mantenido a 100% de A durante 40 min. 1.

carga ajustable con sintéticos divalentes y el pH) trivalentes (t) 60 *Debido a que la mayoría de los analitos son conocidos por ser ácidos.Interacciones hidrofóbicas Fase móvil  SAX (amonio)* = insensible a cambios de pH 50% acetonitrilo Factores de Colorantes sintéticos Solución de alta retención grandes responde≠ pH resistencia iónica (sal o para aniones (complejidad) tampón) multivalentes Uso de UV Solución WAX (grupos (NH4)2SO4 Elución de colorantes ionizables. . RESULTADOS Y DISCUSIÓN  Variaciones de los colorantes sintéticos (dimensionalidad de la muestra):  1) Presencia y el número de restos iónicos  2) La hidrofobicidad Naturaleza de fase estacionaria: .

8 min) = tintes neutros y Resolución decente (grupo aniones monovalentes y divalentes) catiónicos t(1 a 3 min) = colorantes aniónicos Concentración de (NH4)2SO4 > 75mM monovalentes t(hasta 7 min) = colorantes aniónicos divalentes Se diluye durante t(8 min en adelante) = la segunda colorantes aniónicos dimensión trivalentes 61 . RESULTADOS MÉTODO (IEC) Rendimiento bueno (ácidos y bases separados) Tiempo muerto (0.

Gama más amplia Métodos de HPLC Limitación a un Método de CL de de colorantes en previamente grupo (ácidos o segunda un cromatograma desarrollados básicos) dimensión rápido (gradiente de elución) Pares de iones (+): • Neutralizar restos aniónicos Mezcla de Compuestos con Baja retención en • Retención (hidrofobicidad colorantes grupos sulfonatos IPC-RP por cadenas alquílicas [TBA y TMA]) 62 .

Poca retención hidrófoba adicional . Efecto fuerte de par de iones sobre la retención (indeseables) Retención por # de grupos aniónicos = correlación CL×CL (NO ORTOGONALIDAD) Mezcla completa a pH = 3 .Selectividad por esqueleto hidrocarburos (colorante) 2 Mayor retención y agrupamiento de picos en A Mejor (X) difusión y 1 no. de picos en B (√) 254 nm (detección universal)= desviación de línea base 450 nm 10 mM TBA Mejores picos 63 .

 Detección universal (254 nm) sin problemas Gráfico de contorno (patrones de distribución de los picos más de línea base.  Solución alternativa uso de WAX que no este basada en una fase estacionaria polimérica:  1) Una fracción inferior de modificador orgánico para mitigar avance en la 2D.  2) Sistema de gradiente utilizando pH diferentes para disminuir ↑[sales] (indeseable). y reducir tiempo de análisis.  Aceptable para el análisis cualitativo buscado. de grupos sulfonato 64  (20) # de grupos halógenos Mayor separación (2D que en 1D). . clara)  Avance significativo de varias fracciones en la 2D (resultado del uso constante de acetonitrilo [50%] en 1D para mejorar la ortogonalidad del sistema CL×CL para evitar hidrofobicidad adicional).  Aplicación de gradiente exponencial (en vez de lineal) para reducir el ensanchamiento de colorantes multivalentes.  Tiempos de retención inesperados (tarde):  (13) # de grupos nitro Varios compuestos para un colorante (3ª) ≠ No.

 Se observó una buena ortogonalidad entre las dos separaciones.  En la segunda dimensión la retención se determinó principalmente por la estructura molecular del colorante.  La capacidad máxima del método LC × LC desarrollado es del orden de 2000. CONCLUSIONES  Se demostrado la separación de una mezcla altamente compleja. minimizó la retención hidrofóbica. 65 .  El tiempo total de análisis fue de aproximadamente tres horas.  La separación de los colorantes se basó en su carácter iónico (carga y tamaño efectivo). lo que constituye un gran avance en los estudios sobre la composición y el estado de degradación de los colorantes sintéticos.  La presencia constante de acetonitrilo al 50% en todo el gradiente.