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Tecnologia do DNA Recombinante

Isabel Oliveira

As modificações genéticas surgiram
como uma consequência do cultivo

A representação de
sementes de plantas
‘boas’ aumentava
em gerações
subsequentes

Variação
natural entre
a população

Atualmente • Conhecimentos científicos. Darwin • Modificação de fato nos organismos • Formação de híbridos • DNA recombinante: Descrito primeiramente em 1972 por Paul Berg . DNA • Ex: teorias de Mendel.

.DNA recombinante DNA Recombinante são moléculas de DNA que possuem fragmentos de DNA derivados de duas ou mais fontes Tem como base a clonagem molecular.

DNA recombinante .

que rapidamente degrada RNA em subunidades de ribonucleotídeos. 5. Remoção de lipídios. Isto pode ser feito utilizando métodos físicos ou químicos. O primeiro passo envolve a quebra da célula para acessar o DNA. A remoção do RNA é feita adicionando uma RNAse.br/method/DNA-Extraction-and- Purification. 4. Desproteinação do extrato celular. 3. Lise celular. Após a desnaturação. A desnaturação proteica é feita utilizando proteases como pronases e proteinases K. e por centrifugação. Este passo normalmente é opcional na maioria dos kits.html Atualmente kits comerciais permitem a extração rápida de DNA de .labome. 2. Remoção do RNA.com. Isto normalmente é feito utilizando detergentes como SDS. Remoção ou separação da membrana lipídica e restos celulares. Precipitação/agregação/eluição de DNA http://www.Como obter o DNA Os passos básicos envolvidos na extração do DNA consistem de: 1. as proteínas são separadas do extrato celular.

Vetor São moléculas de DNA capazes de amplificar. Todo vetor precisa ter: • Uma origem de replicação • Um marcador selecionável • Sítio de restrição para endonuclease (ao menos um) . Existem diferentes tipos de vetores possuindo cada um particularidades. a informação genética que neles foi inserida. em centenas de cópias.

Tipos de vetores: 1) Plasmídeos 2) Fagos 3) Cosmídeos 4) Fagemídeos 5) Cromossomos artificiais de bactérias 6) Cromossomos artificiais de leveduras 7) Vírus .

Plasmídeo • Pequenas moléculas de DNA dupla fita circulares • Geralmente não codificam genes fundamentais mas conferem resistência a antibióticos • Presente em bactérias e algumas leveduras • Aceitam insertos de DNA de até 5 kb (principal desvantagem) • Não é muito eficiente (menos de 1 em 1000 plasmídeos são transformados) .

Enzima de restrição • Existem 3 tipos • Tipo II é a mais importantes • Reconhecem segmentos de 4-8 bp. precisam de Mg2+ como cofator • Sequência palindrômicas • Cliva em dois lugares .

DNA Recombinante • DNA de interesse(inserto) • Vetor • Enzima de restrição • DNA Ligase • Célula hospedeira .

Transformação Inserção do plasmídeo na bactéria (ou seja. . Plasmídeos pequenos são mais eficientes. formando poros na membrana da bactéria. inserir o vetor recombinante dentro do hospedeiro) • Eletroporação – Aplicação de corrente elétrica.

Eletroporador .

Após um choque térmico na temperatura de 37º a 42ºC. criam-se poros na membrana e o DNA pode alcançar o interior da célula .Transformação Inserção do plasmídeo na bactéria. • Choque térmico (transformação com cloreto de cálcio) Os íons atuam neutralizando as cargas negativas da membrana e do DNA.

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diretamente no citoplasma das células alvo. • Microinjeção .Transformação Outros exemplos: • Biobalística Injeta partículas (geralmente metais pesados) recobertas com preparações de DNA (plasmídeos) que contém o gene de interesse.

Seleção de células transformadas • Resistência a antibióticos .

. cada sem o plasmídeo contendo um cepa expressa uma proteína gene para a proteína de fluorescente de cor diferente fluorescência verde.coli.Seleção de células transformadas • Fluorescência Colônias bacterianas com e Cepas distintas de E.

como insulina. hormônio do crescimento e fatores de coagulação sanguínea.Aplicações • Organismos Geneticamente Modificados (OGM) • Bibliotecas genômicas • Estudo da estrutura dos genes • Substâncias com aplicação médica ou farmacêutica. . • Etc.

Resumo DNA Recombinante • Transformação:  Eletroporação  Choque térmico  Biobalística  Microinjeção • Seleção das células transformadas :  Resistência a antibióticos  Fluorescência .