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PREPARACIN DE MEDIOS DE

CULTIVO
La finalidad es aprender a preparar
correctamente los principales medios de
cultivo que se utilizan en el laboratorio de
Bacteriologa, como uso de los
instrumentales, la dignosticacin de
bacterias patgenas dentro de los
individuos. Asimismo, conocer los diferentes
tipos de cultivo, su calcificacin y su
importancia en la diagnosticacin.
Esterilizacin de material de vidrio:
Placas de Petri: Se preparan en paquetes de 8 a 10
placas segn el tamao, envolvindolas con papel.
Tubos: Se tapa cada uno con un tapn de algodn y se
envuelven con papel en paquetes de alrededor de 20
tubos. Se rotula el papel indicando el tamao del tubo
(grande, mediano o chico), fecha y nombre del operador.
Pipetas: Se coloca un algodn en la parte superior de la
pipeta y se envuelve con papel. Tambin se pueden
esterilizar en recipientes de vidrio o metal (pipeteros), en
grupos de unas 10 pipetas.
Se esterilizan en horno a 180 C 1 hora o en autoclave 15
minutos a 121C
Los diferentes medios y tcnicas de cultivo son
esenciales en el laboratorio de microbiologa de
un hospital, pues sirven para identificar las
bacterias causantes de las enfermedades
infecciosas y los antibiticos a los que son
sensibles esas bacterias.
Los requerimientos necesarios para un cultivo de
bacterias son:
Medio de carbono.
Presencia o ausencia de oxigeno.
Atmsfera adecuada.
Agar-agar.
Para un cultivo adecuado de bacterias y
microorganismos, se utiliza el agar, un gel coloidal
formado por hidratos de carbono, de extendido
uso comercial, y que proviene de las paredes
celulares de varias especies de algas rojas, en
concreto de miembros orientales del gnero
Gelidium. El agar se extrae de las algas marinas
hacindolas hervir. Posteriormente, el producto
resultante se deja enfriar y secar, y al final se
solidifica en pastillas o en escamas. Pero existen
diferentes tipos de agar de acuerdo a las
especificidades que cada uno tenga, sin embargo
cada tipo de agar debe de cumplir con los
requerimientos:
Fuente de energa.- Las bacterias pueden ser fottrofas o
quimiottrofas. Las fotottrofas absorben energa del sol y
las quimiottrofas de compuestos orgnicos.
Fuente de nitrgeno.- Las bacterias pueden obtener el
nitrgeno atmosfrico a travs de las protenas o por la
degradacin de aminocidos o pptidos.
Azufre y fosfatos.- La obtienen como elemento(S), y
como fosfatos en sales (P).
Agua.- Medio de transporte que permite una mejor
absorcin de los nutrimentos.
Protenas.- Se suministran generalmente peptonas, que
se encuentran disponibles en el comercio, preparadas por
digestin parcial de carne con enzimas peptdicas;
Carbohidratos.- Sumistran carbono para la sntesis, y
adems su fermentacin libera energa utilizable en el
metabolismo.
Factores accesorios de crecimiento.- Son
tambin requerimientos por algunas bacterias.
Entre ellos estn las vitaminas del complejo B;
estas suministran enzimas necesarias para que las
bacterias que son incapaces de sintetizar otros
factores necesarios para algunas bacterias sean
obtenidas de los nutrimentos ms complejos.
Sales minerales.- Elementos como K, Ca, Na,
etc.; tambin son requeridas por algunas bacterias
en su desarrollo.
Atmsfera.- Algunos microorganismos precisan
oxgeno para su desarrollo, otros son incapaces de
reproducirse en presencia de este elemento, en
cambio otros organismos pueden crecer en una
atmsfera con oxgeno, logran sobrevivir y crecer
sin el, se les llama anaerobios facultativos.
Presin osmtica.- Las clulas pueden
encogerse y ser destruidas en soluciones
hipertnicas; inversamente se rompen por entrada
de agua, en las soluciones hipotnicas.
Temperatura.- La temperatura para la cual los
organismos microbianos crecen mejor, es
considerada como temperatura ptima.
Luz.- La mayora de las bacterias se desarrollan
mejor en ausencia de luz. La luz ultravioleta
puede ser letal.
Reaccin.- La mayora de las bacterias crece en
un medio ligeramente alcalino (pH 7.2 a 7.6). Los
hongos crecen con facilidad en los medios cidos
(pH 5).
FORMAS Y MTODOS DE CULTIVAR:
Mtodo de placas.- consiste en inocular cantidades sucesivas
menores de material en el medio, de manera que en algn tiempo
sean colocados en una capa tan delgada que les permita el
crecimiento de colonias individuales aisladas.
Medios inclinados.- Este tipo de cultivo es empleado principalmente
para resembrar cepas aisladas, sea para identificacin interior o para
base cultivo.
Cultivos por agitacin.- Este medio de cultivo es empleado
particularmente en el aislamiento de anaerobios esporulado. Se
calienta un tubo o botella a 50C y luego se deja enfriar.
Cultivos por picadura.- En este mtodo el material de laboratorio es
colocado en un alambre recto e introducido al medio. El mtodo puede
ser tambin empleado para conservar los cultivos patrn.
Cultivos lquidos.- Al inocular en un medio lquido como el agua con
peptona o el caldo con tioglicolato, el tubo se inclina y el material se
extrae del asa por frotamiento contra la pared del tubo.
Clasificacin de acuerdo a las
especificidades del medio.
Medios bsicos.- Son los medios ms simples, contienen extracto de
carne, peptona, sal y agua. El extracto o infusin de carne proporciona
aminocidos, vitaminas, sales y pequeas cantidades de elementos como
C, N y otros elementos. Ejem: Agar de infusin, Agar cerebro-corazn.
Medios enriquecidos.- Son aquellos medios bsicos que han sido
complementados con lquidos corporales, vitaminas especficas,
aminocidos, protenas y otros nutrientes. Ejem: Agar sangre y agar
chocolate.
Medios selectivos.- Son medios de agar bsico, enriquecidos
agregndole ciertos reactivos que impiden el crecimiento de la mayora de
las bacterias y permitiendo el desarrollo de unas cuantas. Ejem: Agar con
sangre y bilis al 40%, Agar sal y manitol.
Medios diferenciales.- Son medios a los que se les han agregado ciertos
que reaccionan con un tipo especfico de bacterias. Ejem: Agar de
McConckey, Agar EMB, Agar XLD.
Medios de enriquecimiento.- Son los medios que contienen alguna
sustancia inhibidora por lo que se crea un medio favorable para lmites
mas estrechos de bacterias. Ejem: Agar S.S., Agar de Lowensten-Jensen.
Medios especiales.- Son los medios para comprobar una o ms
caractersticas bioqumicas. Ejem: Agar CIT, Agar LIA, Agar MIO.
SIEMBRA:
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de muestra
(inculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo
microbiano. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una
temperatura adecuada para el crecimiento.
La siembra puede realizarse en medio lquido, slido o semislido,
utilizando punta, ansa, hisopo o pipeta estril.
Cultivo en medio lquido: Habitualmente se realiza en tubos o en
matraces. El crecimiento se puede manifestar por enturbiamiento, por
formacin de velo o pelcula.
Cultivo en medio slido: Puede ser en tubos o placas.
a) Tubos con agar inclinado. Para sembrarlos, se mueve el ansa o la
punta suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en
zigzag desde el fondo hasta la parte superior, cuidando de no daar el
agar.
b) Tubos sin inclinar. Se siembran introduciendo una punta en el
centro del agar. Tambin se llama siembra por picadura.
c) Siembra en placas. Puede ser en superficie o
incorporada.
En superficie: Se colocan 0.1 mL de la dilucin de la
muestra con pipeta estril en el centro de la placa, y se
distribuye con un rastrillo estril.
Se siembra con un ansa para aislar, como se explica ms
adelante.
Se siembra con un hisopo.
Incorporada: Se coloca 1 mL de la muestra en una placa
estril vaca, en el centro de la misma. Sobre ella se agregan
20 mL de medio de cultivo fundido y termostatizado a 45C;
luego se agita la placa, movindola 4 veces en sentido
horario, 4 en sentido antihorario, una vez de arriba a abajo,
una vez hacia los costados y una vez en sentido antihorario.
En medio slido cada clula viable dar origen a una colonia
y por lo tanto la siembra en placas se puede utilizar, no solo
para cultivar microorganismos, sino adems para contar y
aislar.
AISLAMIENTO
Aislar: Es separar un tipo de microorganismo a partir de un poblacin
que los contiene de varios tipos. En habitats naturales, raramente
encontramos a los microorganismos en cultivo puro (un solo tipo de
microorganismo), por lo tanto es necesario hacer algn procedimiento
de aislamiento para separar e identificar los distintos tipos de m.o.
presentes.
El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra
cuando el o los m.o. estn en una proporcin adecuada.
Cuando el m.o. que se desea aislar e identificar se encuentra en baja
proporcin en la muestra, o interesa un solo tipo de m.o., se lleva a
cabo un procedimiento llamado bsqueda que involucra una primera
etapa de aumento del nmero de microorganismos del tipo que se
desea aislar en relacin al resto de la poblacin. Luego se aisla por el
mtodo de estras o por dilucin y se identifica.
Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos:
aislamiento por estras
aislamiento por dilucin
Aislamiento en placa por estras:
Existen distintas tcnicas, el objeto es obtener colonias
aisladas.
Tcnica a.
Consiste en cargar el ansa con la muestra y hacer estras
paralelas en la cuarta parte de la superficie de la placa; se
quema el ansa, se enfra, se gira la placa 90 y se vuelve a
estriar tocando 3 o 4 veces el rea sembrada inicialmente
y cubriendo otro cuarto de placa. Por ltimo, sin quemar el
ansa, se estra el resto de la superficie sin sembrar.

Tcnica b.
Con el ansa cargada se hacen 3 o 4 estras; se quema el
ansa, se hacen 3 o 4 estras perpendiculares a las
anteriores, se quema el ansa y se repite el procedimiento
hasta agotar la superficie de la placa.

Aislamiento por dilucin en medio slido:


Se emplean tanto el mtodo de siembra
incorporada como el de siembra en superficie,
suele ser necesario diluir la muestra. Para ello se
puede preparar las diluciones decimales en
condiciones aspticas usando suero fisiolgico o
algn otro diluyente.
La siembra incorporada se realiza tal como se
describi anteriormente, tambin se pueden
preparar las diluciones directamente en tubos de
agar fundido y termostatizado (20 mL) se agita por
rotacin entre las manos y se vierte en placas de
Petri estriles.
Aislamiento de microorganismos anaerobios
Para aislar microorganismos anaerobios que son
rpidamente destruidos por exposicin al oxgeno, las
placas pueden ser preparadas en la forma usual, y luego
de sembradas, incubadas en recipientes cerrados en
atmsfera sin oxgeno.
Tambin se puede sembrar diluciones en tubos con agar
fundido y termostatizado que luego se tapan con una capa
de vaselina-parafina, para evitar el acceso de aire.
Con anaerobios ms sensibles al oxgeno, se trabaja en
cmaras anaerobicas, o tambin usando la tcnica del
"roll-tube", que es un tubo en el que el agar se deposita en
las paredes al hacerlo girar mientras se enfra; se trabaja
gaseando el tubo continuamente con gas libre de O2
mientras el tubo est destapado.
Descripcin de colonias:
Las colonias de microorganismos se pueden describir
teniendo en cuenta el tamao, color, superficie, etc.
Tamao:
Grande dimetro mayor a 1 mm
Mediana dimetro aproximadamente igual a 1 mm
Pequea dimetro menor a 1 mm
Color:
Blanco, Crema, Amarillo limn, Negro, etc
Superficie:
Brillante, Lisa, Granular, Rugosa
Consistencia:
Viscosa, Mantecosa, Friable (se disgrega al tocarla)
Densidad (con luz a travs de la colonia)
Opaca, Transparente, Traslcida
Forma

Puntiforme Circular Filamentosa Irregular Rizoide Lanceolada


ANTIBIOGRAMA:
Por qu realizar un antibiograma?
El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de
una cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de una
infeccin a uno o varios antibiticos. En efecto, la sensibilidad in vitro
es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un
tratamiento antibitico. El antibiograma sirve, en primer lugar, para
orientar las decisiones teraputicas individuales.
El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolucin de
las resistencias bacterianas. Gracias a este seguimiento
epidemiolgico, a escala de un servicio, un centro de atencin mdica,
una regin o un pas, es como puede adaptarse la antibioterapia
emprica, revisarse regularmente los espectros clnicos de los
antibiticos y adoptarse ciertas decisiones sanitarias, como el
establecimiento de programas de prevencin en los hospitales.
Hay pues un doble inters: Teraputico y epidemiolgico.
Cundo realizar un antibiograma?
Siempre que una toma bacteriolgica de finalidad
dagnstica haya permitido el aislamiento de una bacteria
considerada responsable de la infeccin.
Establecer esta responsabilidad exige una colaboracin
entre el bacterilogo y el clnico. En efecto, en ciertas
circunstancias, el microbilogo no podr determinar con
certeza que el aislamiento de una bacteria exige un
antibiograma, sin los datos clnicos que le aporta el
mdico. Por ejemplo, una bacteria no patgena puede ser
responsable de la infeccin de un enfermo
inmunodeprimido o en un lugar determinado del
organismo. La presencia de signos clnicos puede ser
tambin determinante para la realizacin de un
antibiograma (por ejemplo: la infeccin urinaria con un
nmero reducido de grmenes).
Sensibilidad bacteriana a los antibiticos
La determinacin de la Concentracin Inhibidora Mnima (CIM) es la
base de la medida de la sensiblidad de una bacteria a un determinado
antibitico. Es el valor fundamental de referencia que permite
establecer una escala de actividad del antibitico frente a diferentes
especies bacterianas.
Estos diferentes mtodos de rutina permiten categorizar una cierta
cepa bacteriana en funcin de su sensibilidad frente al antibitico
probado. Esta cepa se denomina Sensible (S), Intermedia (I) o
Resistente (R) al antibitco.
Para un determinado antibitico, una cepa bacteriana es, segn la
NCCLS:
Sensible, si existe una buena probabilidad de xito teraputico en el
caso de un tratamiento a la doss habitual.
Resistente, si la probabilidad de xito teraputico es nula o muy
reducida. No es de esperar ningn efecto teraputico sea cual fuere el
tipo de tratamiento.
Intermedia, cuando el xito teraputico es imprevisible. Se puede
conseguir efecto teraputico en ciertas condiciones (fuertes
concentraciones locales o aumento de la posologa).
Interpretacin de un Antibiograma
Certos mecanismos de resistencia se expresan
dbilmente in vitro, cuando se inscriben en el DNA
bacteriano. Su expresin en el organsmo, en
donde las condicones en cuanto a medios son
diferentes, expondra al riesgo de fracaso
teraputico. Para evitar esto, el antibiograma debe
ser interpretado de manera global a fin de
descubrir, a travs de la comparacin de las
respuestas para cada antibitico, un mecanismo
de resistencia incluso dbilmente expresado.

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