UNIVERSIDAD NACIONAL DE JAÉN

FACULTAD DE TECNOLOGIA MÉDICA

ENFERMEDAD DE CARRION

HISTORIA
Período Preinca-Inca
Período del siglo XIX
Se han encontrado
huacos de cerámica La descripción por primera
antropomórfica con vez de la verruga peruana
lesiones verrucosas, de (verruga andícola) como
las culturas Mochica, una nueva enfermedad la
Chimú así como en 4
realiza Tomás Salazar en
monolitos de la cultura
Huaylas. 1858.

En 1531 Pedro Pizarro El hito más importante y
describe una epidemia de trascendental en la historia
verrugas en Coaque, zona de la Bartonelosis, fue el
costera del Ecuador que experimento de Daniel
afectó a los españoles. Alcides Carrión

CONSTRUCCIÓN DEL FERROCARRIL CENTRAL

1885 1913 DANIEL ALCIDES CARRION ALBERTO BARTON Fiebre de la Oroya y Cuerpos Verruga Peruana. dos endoglobulares. . propone el nombre de Bartonella baciliformis. fases de una misma Richard Strong enfermedad.

VECTOR:LUTZOMIA SPP. Hábitat: 500-3200 msnm En Perú: (sierra) L. robustus L. verrucarum L.Bagua (selva) L. peruensis En Jaén. maranonensis . Mosquitos.

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EPIDEMIOLOGIA .

MICROBIOLOGIA
La Bartonella baciliformis es una bacteria
gram negativa pequeña, (0.3-0.5 umde
ancho, 1-1.7 um de largo).
Intracelular facultativo.
Cocobacilo pleomorfico, aerobica, no
fermentadora.
Catalasa y oxidasa negativa.
Movil con flagelos polares.

INVASIÓN DE LA CÉLULA ENDOTELIAL Y ERITROCITOS

INMUNIDAD E INFECCION
Un factor que complica el aclaramiento de la bacteria es el
comportamiento intra-eritrocitarios de Bartonella siendo protegida
de la respuesta inmune celular y humoral debido la falta de
moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad en superficie
del eritrocito maduro.
Los eritrocitos no pueden presentar los antígenos de sus invasores
al sistema inmune.

ASPECTOS CLINICOS .

Pneumocystis. histoplasmosis diseminada y sepsis debida a Shiguella. toxoplasma. Linfoadenopatías. Ictericia. Staphylococcus y Enterobacter. . Hepato y Esplegnomegalia. Transtornos de conciencia (somnolencia-coma) INFECCIONES OPORTUNISTAS: Salmonella typhi y no typhi. FASE AGUDA Fiebre de la Oroya Anemia severa. etc.

Desaparición de síntomas y signos. FASE INTERCALAR Se detiene la hemolisis. Bacteriemia ausente. Duración aproximada de 1-3 semanas (hasta meses) .

Estas son de superficie lisa. FASE CRONICA Población pediátrica de áreas endémicas. no dolorosas. de color rojo violáceo y pueden sangrar fácilmente. Las lesiones afectan piel y mucosas. sin que hayan tenido un cuadro típico de fase aguda. . no se han detectado en vísceras.

VERRUGA PERUANA TIPO MILIAR TIPO MULAR TIPO NODULAR .

. COMPLICACIONES GESTANTES PARTO PREMATURO OBITO FETAL PURPURA NEUROBARTONELLOSIS NEUROBATONELLOSIS: Hipoxia severa por anemia y presencia de parásitos. reacción parénquima y exudados. tendrían mayor contacto con el endotelio cerebral produciendo lesiones tisulares.

EL DIAGNOSTICO El diagnóstico en la fase aguda puede ser realizado usando el frotis de sangre periférica teñido con Giemsa. . Es posible observar los bacilos dentro de los eritrocitos.

DIAGNOSTICO: FROTIS SANGRE ERIFERICA FORMAS BACILARES FORMAS COCOIDES .

COMPROMISO HEMATOLOGICO .

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DIAGNÓSTICO PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO PROCEDIMIENTOS DE OBTENCIÓN DE MUESTRAS. 1. colocadas en recipiente estéril.   3. Para diagnóstico histopatológico:  Biopsias de las lesiones en formol al 10% . heparina o EDTA. La efectividad y éxito del diagnóstico bacteriológico depende en gran medida de la obtención y el transporte oportuno de las muestras al laboratorio. por esta razón el equipo de salud involucrado debe entender la naturaleza crítica de mantener la calidad de las muestras durante todo el proceso. Para el diagnóstico directo:  Frotis sanguíneo de sangre periférica en láminas portaobjetos.cultivo:  Sangre total con anticoagulante en tubos al vacío con citrato de sodio. 2.  Biopsias de las lesiones. Para aislamiento .  Sangre total inoculada directamente al medio de cultivo bifásico (inmediatamente después de la extracción de la muestra sanguínea).

. No colocar la cantidad adecuada de sangre en la lámina. MUESTRAS DE SANGRE Para la obtención de muestras de frotis sanguíneo y sangre total seguir las indicaciones del Manual de procedimientos de laboratorio para la obtención y envío de muestras ERRORES COMUNES AL PREPARAR LAS MUESTRAS DE FROTIS SANGUINEO 1. El tamaño de la gota para hacer el frotis sanguíneo. idealmente es una gota similar a aquella formada cuando se hace una gota con una aguja hipodérmica Nº 21.

2. No usar láminas mal enjuagadas. No colorear las muestras mucho tiempo después de haberlas obtenido. 7. 6. 4. No usar láminas con borde astillado o irregular para hacer el frotis. No guardar las muestras inadecuadamente. No preparar las muestras sobre láminas rayadas. . No usar láminas con grasa (sin lavar) para hacer el frotis. 5. 3.

Materiales para la obtención de biopsias  Ficha de información básica. #5.  Sacabocados  dermatológico  (punch).  Frascos estériles con formol al 10%. OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE TEJIDOS MEDIANTE BIOPSIAS DE ERUPCIONES O VERRUGAS. según el tamaño de la lesión: #3.  Fichas de consentimiento informado. . #6  y #8. #4.  de  diferentes  diámetros.

cocobacilares o cocoides. PROCEDIMIENTOS COLORACIÓN DEL FROTIS SANGUÍNEO CON GIEMSA La coloración de Giemsa es una modificación de la coloración de Romanowsky. está disponible en cualquier laboratorio y nos permite detectar los glóbulos rojos infectados por Bartonella bacilliformis en sus formas bacilares. La muestra debe ser fijada con metanol antes del proceso de tinción .

Proteger el frotis del polvo. 6. (La dilución y el tiempo de coloración se ajusta de acuerdo con las características del colorante preparado). previamente fijados sobre la varilla. Descartar el colorante y lavar la lámina a chorro suave y continuo de agua de caño hasta que arrastre todo exceso de colorante. 4. 3. Colocar las láminas inclinadas en una gradilla para que escurra el agua y dejar secar a temperatura ambiente. 2. para facilitar la eliminación de los líquidos usados en la coloración. . Se cubre la extensión con el colorante de trabajo diluido 1:10 por 15 minutos. PROCEDIMIENTO DE LA COLORACIÓN DE LA MUESTRA SANGUÍNEA 1. 5. separadas una de otra para poder manipularlas con seguridad. Colocar la varilla de vidrio sobre un lavatorio o recipiente. Se colocan las láminas con los frotis sanguíneos.

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libre de precipitado. 3. con la muestra del frotis hacia abajo. 8. 5. 2. 6. es decir. Descartar el colorante y lavar la lámina a chorro suave y continuo de agua de caño hasta que arrastre todo el exceso de colorante. Vaciar el colorante de trabajo a la altura de cada lámina sobre la bandeja y dejar fluir el colorante por debajo de cada una de ellas. 4. En esta forma de coloración. Entre lámina y lámina debe haber una distancia tal que permita correr o agregar el colorante a cada una de las láminas. Colocar a bandeja de coloración sobre una superficie plana de preferencia cerca de un lavatorio. COLORACIÓN MEDIANTE LÁMINA INVERTIDA 1. Colocar las láminas inclinadas en una gradilla para que escurra el agua y dejar secar a temperatura ambiente.20 minutos 7. Colocar las láminas fijadas con metanol que se van a colorear en forma invertida. En este procedimiento el colorante de la bandeja puede ser reusado hasta por tres veces. 9. el precipitado del colorante se va al fondo de la bandeja quedando la superficie en contacto con el frotis. Dejar colorear por 15 . .

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cuyo pH no sea tan extremo como el ADN pueden adquirir coloraciones entre el azul y el púrpura. como el ADN. FUNDAMENTO DE COLORACIÓN GIEMSA La eosina es un tinte ácido. Por otra parte el azul de metileno tiene un pH básico y unirá estructuras y moléculas ácidas. por lo que unirá estructuras básicas como el citoplasma o los eritrocitos. por lo que teñirá de azul o purpura los núcleos.5 para que la tinción no esté descompensada. . Otras estructuras celulares. Las bacterias al tener su ADN en el citoplasma se tiñen de azul por completo. El pH del tinte debe estar equilibrado entorno al 6.

se leerán 50 campos. . Se lee de 50 a 100 campos por lámina con la muestra de frotis sanguíneo a 1000 aumentos. se debe leer toda la lámina. 6. 8. Si se observa que las células infectadas son menos del 50%. ya sea bacilar. OBSERVACIÓN Y LECTURA MICROSCÓPICA DE LOS FROTIS SANGUÍNEOS   1. para lo cual se cuenta 100 hematíes y se determina cuántos están infectados. se observan hematíes deformados y muchas veces toman la forma ameboide. 4. con menos frecuencia se ven formas cocoides. Si se observa que el porcentaje de hematíes infectados es menor a 5%. cocobacilar o cocoide. Las formas cocoides se encuentran en pares o cadenas. 7. El resultado de la lectura del frotis sanguíneo se expresa en porcentaje de hematíes infectados. Si se observa un solo hematíe con forma cocoide es preferible revisar toda la lámina. 3. En el reporte se debe colocar las formas bacterianas observadas. 10. En la lectura se debe tener en cuenta: a) Índice de bacteriemia b) Forma de las bacterias 2. separadas o en grupos dentro de los hematíes. 5. Si se observa que las células infectadas son más del 50%. es posible que no sea la forma cocoide sino algún artefacto. En un frotis positivo. En la fase aguda de la enfermedad se observan predominantemente formas bacilares de color rojizo o violeta. se leerán 100 campos. 9.

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precipitados del colorante.ERRORES DURANTE LA LECTURA DE LÁMINAS Los errores más frecuentes son confundir las formas cocoides con punteado básofilo. células de Heinz o con reticulocitos en los cuales se colorea el núcleo. .

El mayor porcentaje de aislamientos (70-80%) se logra en las dos primeras semanas de incubación. DIAGNÓ El aislamiento de Bartonella bacilliformis se puede realizar en los siguientes medios: 1. 2.1% y una fase líquida con medio RPMI suplementado con suero fetal bovino. una alternativa para la fase líquida es el medio RPMI sin suplemento o infusión cerebro corazón. constituido por una fase sólida de agar Columbia con sangre de carnero al 10% y extracto de levadura al 0. En agar Columbia con sangre de carnero al 10% en placas Petri. 3. . En medio de cultivo bifásico distribuido en frascos. en la tercera y cuarta semana se obtiene el resto (20-25%).

 Alcohol de 70°.  Estufa de 28 a 29°C.MATERIALES PARA EL CULTIVO  Jeringa descartable con aguja.  Tubos al vacío conteniendo la muestra de sangre total.  Guantes estériles. .  Algodón.  Pipetas de transferencia descartables estériles.  Contenedor de material contaminado.  Medios de cultivo.

Extraer la muestra con una jeringa. luego cerrar la placa. . Inocular de 0.PREPARACIÓN DE LA MUESTRA SANGUÍNEA Para incrementar el aislamiento de B. Dejar que los medios de cultivo tomen temperatura ambiente. 5. 3.   PROCEDIMIENTO PARA EL CULTIVO EN PLACAS: Colocar en la cabina de seguridad el material necesario para el cultivo de la muestra sanguínea. dejando que la sangre fluya sobre la superficie del medio. a través de la tapa de jebe o con pipeta de transferencia. 4. Desinfectar con alcohol de 70º la tapa de jebe del tubo al vacío que contiene la muestra.5 a 1mL de sangre sobre el agar Columbia. 2. Rotular con el código del paciente las placas con agar Columbia sangre. 1. bacilliformis de la sangre es conveniente lisar los eritrocitos por medios mecánicos como el de centrifugación de la muestra.

de lo contrario se debe utilizar el medio de cultivo bifásico. 7. 8.6. Incubar el cultivo a 28 ºC hasta por 45 días. Colocar la placa con la muestra sembrada en bolsas de polietileno de baja densidad autosellables para mantener la humedad del medio de cultivo que debido al largo período de incubación se seca y para evitar contaminación con hongos saprofitos. se debe usar un mechero de gas que dé a su alrededor un amplio radio (espacio) de esterilidad o. En el caso que el laboratorio no tenga las facilidades ideales para poder realizar el cultivo sin correr el peligro de contaminarlo.   .

se logra una buena observación de las reacciones hemolíticas ya que la bacteria Bartonella baciliformes no hemolisa los hematíes. El almidón y Con el agregado de 5-10 % de sangre (de carnero. . el extracto de carne y el extracto de levadura proporcionan condiciones favorables de crecimiento para el aislamiento de microorganismos exigentes. FUNDAMENTO DEL AGAR COLUMBIA Las peptonas. de caballo).

Incubar el cultivo a 28-29 °C hasta 45 días.cámara de bioseguridad. inocular a través del tapón de jebe 0. 5. 3. Inmediatamente..5 a 1mL de sangre al frasco con medio de cultivo bañando la fase sólida. Limpiar con un algodón empapado con alcohol la tapa del frasco. 6. 7. 4. Extraer con una jeringa la sangre total del tubo que contiene la muestra de sangre. Se deja reposar el frasco inclinado hasta que la sangre se impregne en el agar por 30 minutos. Descartar la aguja y la jeringa . Este procedimiento debe realizarse cerca de un mechero. 2.   . PROCEDIMIENTO PARA EL CULTIVO EN MEDIO BIFÁSICO: 1.

4. en el Laboratorio de Referencia Regional o Nacional (punto 4.4. 3. Bartonella bacilliformis colorea muy débilmente con la tinción de Gram.). En el aislamiento primario las colonias de B. Los cultivos pueden ser crioconservados en medio de infusión cerebro corazón con 10% de glicerol a -70 ºC. bacilliformis. translúcidas tipo rocío o blanquecinas. Son colonias pequeñas de apenas 1 mm de diámetro. crecen lentamente. Realizar un subcultivo de las colonias sospechosas. 5. Gram. Examinar los cultivos visualmente con luz transmitida o con una lupa. 2. Si se ve desarrollo de colonias entre las 24 y 72 horas. no se trata de B. todos los días hasta por 45 días. 7. 6. Gram y bioquimica.   . bacilliformis se desarrollan entre cuatro días a seis semanas de incubación.CULTIVOS EN PLACAS: 1. LECTURA DE CULTIVOS .

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realizar subcultivos ciegos a los 15 días. bañar la fase sólida del medio con la fase líquida 2. Si se carece de una incubadora de la temperatura indicada-T ambiente y enviarlos. Si no se observa crecimiento de colonias o turbidez después siete u ocho días. . 4. Si a las 24 ó 48 horas se nota desarrollo de colonias sobre el plano inclinado de la fase sólida o se nota turbidez o lisis de los hematíes en la fase líquida. Si se observa crecimiento de colonias. 3. realizar un subcultivo en placas con agar Columbia sangre. En el caso del medio bifásico. 6. turbidez o hemólisis después de seis a siete días de incubación. 5. Los cultivos deben seguir incubándose hasta por 45 días.  CULTIVOS EN MEDIO BIFÁSICO 1.

Con una jeringa de tuberculina estéril. puede hacer un cultivo en medio bifásico. 7. 3. Incubar los cultivos a 28-29 ºC y observar hasta por 45 días. Observar los cultivos con luz transmitida todos los días. . Desinfectar la tapa del frasco de hemocultivo con alcohol 70 º. 6. extraer 200 μL de la fase líquida del medio e inocular en la superficie de placas con agar Columbia sangre y colocar una gota sobre una lámina para hacer un frotis y coloración Gram. Observar la lámina coloreada con Gram y buscar formas bacterianas. Los subcultivos también pueden realizarse en frascos con medio bifásico. 2. 4. 8. En el caso que se haya realizado la siembra primaria en placas con agar Columbia y se noten colonias sospechosas. 5. SUBCULTIVOS 1. Los subcultivos deben realizarse en cabina de bioseguridad.

las colonias crecen entre los 4 y 14 días.29 ºC. entre 28 . debe observarse el subcultivo hasta los 45 días. Las condiciones requeridas para el desarrollo bacteriano. . Generalmente.  El aislamiento primario es lento. LECTURA DE LOS SUBCULTIVOS: Después de varios pasajes de cultivos o subcultivos sucesivos.  El período de incubación.     IDENTIFICACIÓN DE BARTONELLA BACILLIFORMIS La identificación del género se realiza por: 1. desarrolla desde los 4 hasta 45 días.  Desarrolla sólo en medios enriquecidos. el crecimiento de las colonias es más rápido y se hacen visibles después de tres a cuatro días de incubación. como:  La temperatura de crecimiento. sin embargo.

. 8. forman una banda de desarrollo bacteriano de aproximadamente 6 mm. son bioquímicamente inertes.   2. con migración del cultivo desde el trazo de inoculación hacia las paredes del tubo. 9. catalasa positiva. Son Gram negativos. No crecen en medio de agar Mac Conkey o agar nutritivo. 5. de borde entero. 3. No fermentan los azúcares.La morfología de la colonia y las características de crecimiento probablemente estén relacionadas con la patogenicidad del microorganismo. Son oxidasa negativa. ureasa e indol negativo. 6. 4. Son móviles. lo que se observa en el medio de gel de fases. No crece a 37 ºC. No produce hemólisis en agar Columbia con sangre de carnero. Las colonias son pequeñas. puntiformes y translúcidas. 7.

Si el subcultivo es en medio bifásico: Coger con una pipeta estéril de 0. bacilliformis deben ser almacenados bajo condiciones de crioconservación. c.   CRIO CONSERVACIÓN DE LAS CEPAS Los aislamientos que tengan características compatibles a B. Procedimiento: 1. Si el subcultivo es en placa: Si se tienen subcultivos positivos y con colonias de un solo tipo. 2. Las cepas deben guardarse por duplicado o más a -20 o -70 ºC .2 mL de la fase líquida del medio e inocularlas en crioviales.5 . coger con una asa de siembra las colonias (cosechar) e inocularlas en crioviales con medio infusión cerebro corazón con glicerol 10%.

secundaria a la infección por dos especies de bacilos Gram negativos del género Bartonella : Bartonella henselae y Barton ella quintana.CORTE HISTOPATOLOGICO La angiomatosis bacilar (AB) es una enfermedad poco frecuente. .

HEMATOXILINA-EOSINA: FUNDAMENTO DE LA COLORACIÓN La Eosina es un colorante ácido (predomina densidad de carga negativa). por lo cual se asocia y colorea estructuras aniónicas (que posean fosfatos. membranas intracelulares. . La Hematoxilina se asocia con mordientes para actuar como un colorante básico. sulfatos y/o carboxilos ionizados): •Heterocromatina y nucléolos •RNA ribosomal •Matriz extracelular. y fibras extracelulares (por sus aminoácidos básicos ionizados). por lo cual se asocia y colorea a estructuras catiónicas del citoplasma y matriz extracelular. tales como: filamentos citoplasmáticos (como los de células musculares).

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. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA Primera  etapa:  se  fijan  sobre  un  portaobjetos  los  antígenos  que  constituyen  el  substrato  conocido  específico  (bacteria)  sobre  él  se  coloca  el  suero  de  quien  se  sospecha la presencia de anticuerpos específicos. si la reacción es positiva se dará  formación de complejo antígeno -anticuerpo no visible ya que el anticuerpo no estaba  marcado.  que  reaccionar á con el anticuerpo del complejo producido en la primera etapa. Segunda  etapa:  se  agrega  una  anti  -inmunoglobulina  humana  marcada.

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INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA .

REACCION DE LA CADENA DE POLIMERASA .PCR.

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. La concentración de ADN de las muestras se midió por espectrofotometría y las muestras se almacenaron a 4°C hasta su uso. el ADN purificado fue eluido de las columnas en 100 mL de agua bidestilada libre de ADNsas. las muestras fueron colocadas en columnas con afinidad por ADN. Luego. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA EXTRACCIÓN DE ADN Las extracciones de ADN genómico a partir de cultivos bacterianos y de sangre total. finalmente. el ADN fue atrapado en las columnas y las impurezas se eliminaron mediante soluciones de lavado.

Este DNA se conoce como DNA molde. Una enzima capaz de generar una copia de DNA a partir del DNA molde: una DNA polimerasa. COMPONENTES DE LA PCR El DNA a partir del cual queremos obtener una copia de un fragmento. Nucleótidos libres: . Iniciadores de la reacción: Estas moléculas son los cebadores o primers de la reacción. el DNA que queremos amplificar. es decir.

. Temperaturas habituales en esta fase oscilan entre 35 y 60ºC. Esta segunda fase se conoce como hibridación. Esta primera fase se conoce como desnaturalización y se lleva a cabo elevando la temperatura a alrededor de 94ºC. El siguiente paso consiste en un descenso de la temperatura para permitir que los cebadores se unan por complementariedad al DNA molde. es decir. que las dos cadenas de DNA se separen. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) El proceso que tiene lugar durante la PCR se puede resumir de la siguiente forma: En primer lugar es necesario que el DNA se desnaturalice.

Estas tres fases constituyen un ciclo de la PCR. ¿Qué se ha obtenido tras un ciclo de PCR? . si se utiliza Taq polimerasa la temperatura de elongación suele ser de 72ºC. en la fase de elongación o extensión.Por último. La temperatura a la que se lleva a cabo esta fase depende de la enzima polimerasa empleada. la enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir del extremo 3’ libre de la región en que han hibridado los cebadores.

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GRACIAS .