FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGIA MEDICA ESPECIALIDAD DE LABORATORIO CLINICO Y ANAT. PATOLOGICA
LIC. TRIGOSO AVALOS WILSON E.
CTMP 6226 CITOGENTICA MOLECULAR CITOGENTICA MOLECULAR Desarrollo de las tcnicas de Citogentica Molecular que utiliza las ventajas de la Citogentica clsica y de la Gentica Molecular. HIBRIDACION IN SITU POR FLUORESCENCIA (FISH) La tcnica del FISH es un procedimiento de citogentica molecular que se fundamenta en el uso de sondas ADN dirigidas especficamente para reconocer secuencias conocidas del ADN cromosmico (Hibridacin) y su posterior visualizacin mediante la fluorescencia, puesto que las sondas estn marcados con fluorocromos. La hibridacin in situ es una tcnica de gran sensibilidad que permite detectar y localizar secuencias especficas de cidos nucleicos en cromosomas, clulas y tejidos preservados morfolgicamente. CITOGENTICA MOLECULAR: FISH La tcnica utiliza fragmentos de ADN ARN marcados (sondas), que hibridan especficamente con sus secuencias complementarias de ADN presentes en cromosomas, clulas interfsicas y mitocondrias ARN citoplsmico, formando hbridos estables que luego pueden ser detectados. La tcnica de hibridacin in situ fue desarrollada en 1969 por Gall y John en dos grupos de trabajo independientes. Cuando se describi por primera vez, la nica posibilidad de marcaje para las sondas era la radioactividad, y la autorradiografa la forma de deteccin. Po otro lado, no estaban desarrolladas tcnicas de clonaje de cidos nucleicos y las nicas sondas disponibles eran secuencias aisladas por tcnicas bioqumicas. Citogentica Molecular: FISH La posibilidad de clonar cidos nucleicos y la mejora de las tcnicas de marcaje han permitido que la hibridacin in situ, se utilice rutinariamente en hospitales para diagnstico y seguimiento de muchas enfermedades.
En estos ltimos aos el marcaje de las sondas ADN con
fluorcromos han permitido desarrollar la metodologa del FISH la que se basa principalmente en la hibridacin in situ, mediante este mtodo es posible la deteccin y localizacin de secuencias especficas de cidos nucleicos en estructuras biolgicas morfolgicamente conservadas.
Este mtodo emplea la capacidad que tiene la Sonda ADN de
encontrar en algn lugar del genoma, una secuencia de ADN complementario y de unirse hibridizar especficamente con ella. Citogentica Molecular: FISH
La Sonda para que cumpla su funcin debe ser de simple
hebra y de una secuencia u origen conocido. Si la sonda y el ADN problema hibridizan la seal fluorescente podr ser observada mediante el microscopio de fluorescencia y as poder confirmar la presencia del segmento cromosmico en estudio. Para poder poner de manifiesto la hibridacin se utiliza un sistema de deteccin muy especial y sensitivo basado en el uso de Sondas Biotiniladas, no radioctivas. Las sondas para FISH disponibles en el mercado pueden ser marcadas con: 1. BIOTINA, la cual se une a la Avidina que previamente ha sido unida al Isotiocianato de fluorescena (FITC) 2. DIGOXIGENINA, que podr ser detectada con Fluorescena o Rodamina unida a la Antidigoxigenina. Citogentica Molecular: FISH La visualizacin de la seal emitida por estos fluorcromos es facilitada por la tincin de los ncleos en interfase y metafases con un medio de montaje que contiene tincin de contraste. Se utilizan como contraste el Ioduro de Propidium cuando se emplea la Fluorescena y el 4,6-diamino-2fenil-indol (DAPI) para la Rodamina. La especificidad y utilidad del FISH va ha depender del problema a resolver y de la sonda elegida. En general existen 3 tipos de sondas:
1. Sondas de Secuencias Repetidas o Sondas Alfa Satlites:
Que identifican secuencias generalmente pericentromricas, muy repetidas, de cada cromosoma, producen seales que se detectan fcilmente y pueden usarse en metafase e interfase. Se utilizan generalmente para detectar ANEUPLOIDAS. Citogenetica Molecular: FISH
2. Sondas de Cromosomas Completos o Sondas Paiting
Son un conjunto de sondas que hibridan especficamente a lo largo de todo el cromosoma. Solo se utilizan en clulas en metafases y permiten la identificacin del par cromosmico que deseemos. Son de gran utilidad para: - Identificar segmentos cromosmicos de origen desconocido -Identificar el origen de cromosomas que participan en un rearreglo complejo. - Identificacin de cromosomas marcadores, imposibles de determinar por la citogentica clsica. Citogentica Molecular : FISH 3. Sondas de ADN de secuencias nicas: Son sondas mucho ms especficas que reconocen un locus determinado y pueden reconocer un gen, incluso una parte de l (desde 1000 pb hasta 300,000 pb). Se utilizan en la deteccin de MICRODELECIONES que no pueden detectarse por citogentica clsica y que son responsables de diferentes sndromes. Tambin son de gran utilidad en el diagnstico, pronstico y seguimiento de enfermos de cncer que presentan clulas con microdeleciones, translocaciones que involucran regiones crticas amplificaciones gnicas. Hasta ahora podan hacerse estudios utilizando varias sondas diferentes simultneamente, con la nica limitacin de que los fluorcromos disponibles pudieran ser detectados como colores distintos por el ojo humano, a travs de un microscopio. Citogentica Molecular:FISH
En la actualidad ya se han puesto a punto la tecnologa
necesaria para el anlisis automtico de imgenes, que permite la utilizacin simultnea de multitud de sondas marcadas con mezclas de fluorcromos (FISH Multicolor) que son percibidas como colores diferentes por el analizador, aunque son distinguibles por el ojo humano. Esta tecnologa permite hibridar todos los cromosomas simultneamente, obtenindose un cariotipo de 24 colores, o incluso obtener un patrn de colores asignando diferentes combinaciones de fluorcromos a sondas de regiones cromosmicas diferentes. En conclusin podemos decir que el FISH es una tcnica de gran sensibilidad y especificidad, que mejora la capacidad de la citogentica clsica en la deteccin de alteraciones. FISH de nucleos interfsicos con una sonda centromrica para el cromosoma 21 se muestran tres seales FISH de una microdelecin en uno de los cromosomas 15 (flecha) , de un nio con Sindrome de Prader-Willi Pintado de cromosomas para mostrar una sutil translocacin entre los cromosomas 10 (azul) y 18 (rojo) FISH mostrando una falla en la sonda especfica del locus WT1 (rojo) en el cromosoma 11 defectuoso de un paciente con sindrome WAGR. La sonda verde actua como marcador centromrico cromosoma 11 FISH mostrando una falla en la sonda especfica del locus PAX6 (rojo) para hibridar en el cromosoma 11 de un nio con Sindrome de WAGR. La sonda verde actua como marcador centromrico del cromosoma 11 FISH mostrando una delecin del cromosoma 4p (rojo) en un nio con Sndrome de Wolf-Hirschhorn. La sonda amarilla acta como marcador centromrico del cromosoma 4 Pintado de cromosomas 5 se observa una insercin de un pequeo fragmento del cromosoma 13 (indica la flecha) Pintado del cromosoma 13 en donde se observa material del cromosoma 13 insertado en el cromosoma 5 (flecha) Pintado de cromosomas mostrando dos cromosomas 17 normales y un pequeo cromosoma en anillo. FISH mostrando Hibridacin del cromosoma Y (amarillo) con el brazo corto del cromosoma X en un varn 46XX FISH MULTICOLOR Citogentica Molecular Hibridacin Genmica Comparativa (CGH) La CGH es una tcnica de citogentica molecular que permite determinar amplificaciones y deleciones de material gentico. Su aplicacin se ha centrado bsicamente en los estudios tumorales. En los ltimos aos, la investigacin gentica del cncer a travs de la citogentica clsica ha encontrado limitaciones, porque en muchos casos el cultivo celular de los tumores no es todo lo bueno que se deseara, ya que no es fcil obtener metafases analizables, adems en cada tumor pueden existir diferentes clones, haciendo del estudio citogentico una ardua y difcil tarea e imposibilitando muchas veces el diagnstico. La necesidad de encontrar una tcnica que permitiera el estudio de cualquier tipo de tumor, evitando el cultivo celular y con ello los problemas que ste conlleva, impulso el desarrollo de la CGH. Citogentica Molecular: CGH La CGH es especialmente usado para revelar regiones importantes en la iniciacin y progresin tumoral como: - La amplificacin o ganancia de ADN - Deleciones perdida del ADN - Origen de cromosomas marcadores supernumerarios El procedimiento del CGH bsicamente consiste en partir de un ADN tumoral marcado con un fluorcromo de un color determinado (verde), que se compara con un ADN normal (control) marcado con otro fluorcromo de distinto color (rojo). Ambos ADN (uno rojo y otro verde) compiten en la hibridacin sobre metafases previamente obtenidas a partir de un cultivo de sangre perifrica de un individuo normal. Luego mediante el uso de un microscopio de fluorescencia que tiene unido un equipo automatizado (ordenador y cmara), se pueden determinar las ganancias y prdidas del material gentico del tumor. CGH mostrando areas de amplificacin gnica y reduccin (delecin) en tumores Citogentica Molecular:CGH Deteccin de Sondas con Marcacion Indirecta Kit de deteccin Reactivo de Deteccin Contraste Digoxigenina-FITC Anti-digoxigenina marcada 0.3 ug/ml de con fluorescena Ioduro Propidium DigoxigeninaRoda Antidigoxigenina marcada 0.1 ug/ml DAPI mina con Rodamina Biotina-FITC Avidina marcada con 0.3 ug/ml IP fluorescena Biotina-Rojo Texas Avidina marcada con Rojo 0.1 ug/ml DAPI Texas Deteccin doble Mezcla de reactivos 0.1 ug/ml DAPI simultanea Citogentica Molecular Citogenetica convencional Fish (Interfase) Requiere clulas en divisin . No requiere clulas en divisin Anlisis global de todos los cromo- . Permite anlizar gran nmero somas de clulas. Admite el anlisis de pocas clulas . Anlisis rpido y sencillo. (15-100) . Permite conocer el tipo de clula La interpretacin precisa de mucha analizada y la frecuencia real experiencia. de clulas con la alteracin . Bajo costo econmico cromosmica frente a la pobla- . No permite establecer a que clula cin celular total . pertenece el cariotipo analizado. . Anlisis puntual de la alteracin que detecta la sonda. . Elevado costo econmico (a ms son- das empleadas, mayor costo). . La deteccin de prdidas cromos- micas es conflictiva ya que siempre se observan clulas sin seal de hi- bridacin (falsas monosomias) . Deteccin de falsas seales de hibri- dacin (background). Citogenetica Molecular Comparacin entre citogenetica y las tcnicas de biologa molecular Citogentica FISH Southern PCR Material de clulas en cultivo No requiere No requiere No requiere estudio cultivo cel. cultivo cel. cultivo cel.
Cantidad de 2x106 clulas 1000 clulas 2x106 clulas 1 clula