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ESPECTROSCOPIA DE

FLUORESCENCIA
TRUJILLO, 12.10.2016
QUE ES ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA?

La espectroscopia de fluorescencia atmica (AFS) es


una tcnica de emisin que ofrece una gran
sensibilidad en la regin ultravioleta. Para que pueda
producirse el proceso de emisin fluorescente,
previamente debe haber tenido lugar un proceso de
absorcin que implicar dos o ms transiciones
electrnicas.
QUE ES LA FLUORESCENCIA?

Es un proceso de interaccin entre la radiacin y la materia en el


cual un material absorbe radiacin de una fuente especfica y
muy rpidamente emite luz cuya energa es menor (de mayor
longitud de onda) que la de la radiacin que ha absorbido.

Los mtodos de fluorescencia se aplican mucho menos que los


mtodos de absorcin debido al numero relativamente limitado
de sistemas qumicos que se pueden hacer fluorescencia.
QUE ES LA FLUORESCENCIA?

FLUORESCENCIA
Tiene lugar por absorcin de fotones.
Es la radiacin UV/Vis que emiten los tomos,
o con ms frecuencia las molculas que se han
excitado al absorber radiacin.
Esta emisin a la que se hace referencia cesa
en 0,1s despus de que la excitacin ha
terminado.
QUE ES LA FLUORESCENCIA?
CMO SE PRODUCE LA FLUORESCENCIA?

Diagrama de Jablonski
CMO SE PRODUCE LA FLUORESCENCIA?

Diagrama de Jablonski
1) La absorcin de la luz de excitacin eleva la molcula del
fluorocromo a un estado de excitacin con un mayor contenido de
energa, S1.
2) En este estado de excitacin se mantienen un tiempo determinado,
de 10-9 a 10-8 segundos, en el cual la molcula sufre cambios
conformacionales e interacciones con las molculas de su entorno.
Como consecuencia, parte de la energa del estado S1 se disipa,
crendose un estado S1 de menor energa.
3) Pasado este tiempo de excitacin la molcula emite luz de menor
energa volviendo a su estado fundamental, S0.
FLUORESCENCIA

Debido a la disipacin interna de energa la luz emitida tiene siempre una


longitud de onda mayor (menor energa) que la luz de excitacin.

La cantidad de luz emitida es muy pequea en comparacin con la utilizada


para la excitacin.

Lo que diferencia a la fluorescencia de la fosforescencia (ambos son procesos


de luminiscencia) es el tiempo de vida ms largo de ste ltimo proceso que
puede ir desde milisegundos a minutos y ocurre despus de que el proceso de
absorcin haya terminado.

Los materiales que fluorescen lo hacen porque contienen estructuras con


configuraciones moleculares particulares conocidas como fluorforos o
fluorocromos.
FLUORESCENCIA

Un fluorocromo es una molcula capaz de


absorber fotones y emitir fotones de menor
energa (mayor longitud de onda).

Un fluorforo es la parte del fluorocromo


responsable de la emisin de la fluorescencia.
ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA
Estructura

La mayora de los hidrocarburos aromticos no sustituidos fluorescen


con una emisin fluorescente creciente con el nmero de anillos y con su
grado de condensacin. Los anillos heterocclicos mas sencillos (piridina,
furano, pirrol, ) no fluorescen pero las estructuras de anillos fusionados
con mas de dos anillos (quinolina, isoquinolina, indol) lo hacen con
frecuencia.
ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA
Instrumentacin

Un fluormetro consta de una fuente de luz y de un sistema de


seleccin de longitud de onda de excitacin. Cuando la
muestra es excitada con radiacin de energa apropiada emite
radiacin en todas las direcciones del espacio. No obstante la
luz emitida se detecta mejor en ngulo recto con respecto al
haz de excitacin ya que se evitan problemas de dispersin de
la luz y tambin el haz de luz excitante que es mucha mayor
intensidad que el haz de luz emitida. La luz emitida es
recogida seleccionando un longitud de onda apropiada y
conducida a un detector donde queda registrada pos sistemas
similares a los de un espectrofotmetro de absorcin..
QUE ES ESPECTROSCOPIA DE FOSFORESCENCIA?

La fosforescencia es el fenmeno en el cual ciertas


sustancias tienen la propiedad de absorber energa y
almacenarla, para emitirla posteriormente en forma de
radiacin. A aquellos elementos que ofrecen
fosforescencia se les conoce como fotoreactivos, es
decir que requieren luz para obtener la propiedad, es
un elemento de la fotosensibilidad que por medio de
la radiacin adquieren la energa necesaria para
almacenarla y exponerla posteriormente.
Comparacin de los mtodos de fluorescencia y
fosforescencia
Ambos son fenmenos considerados de manera general como
fotoluminiscencia.

La fluorescencia difiere de la fosforescencia en que las transiciones


electrnicas responsables de la fluorescencia no implica un cambio
en el espn del electrn.

Como consecuencia de lo anterior, la fluorescencia tiene una vida


ms corta cesando la luminiscencia casi inmediatamente. Por el
contrario, las emisiones de fosforescencia estn acompaadas por un
cambio en el espn del electrn, lo cual hace que la radiacin tarde un
tiempo fcilmente detectable despus de haber acabado la
irradiacin.
QUE ES ESPECTROSCOPIA DE FOSFORESCENCIA?
APLICACIONES

La fosforimetra se ha utilizado para determinar


una gran variedad de especies orgnicas y
bioqumicas que incluyen sustancias como
cidos nucleicos, aminocidos, piridina y
piridina, enzimas, hidrocarburos del petrleo y
pesticidas.
Usos de fluorescencia en bioqumica

Localizacin subcelular
Cambios en la concentracin
Interacciones moleculares
Cambios conformacionales
Distancias intra/intermoleculares
Difusin rotacional
Caracterizacin estructural
Actividad enzimtica
INSTRUMENTOS PARA MEDIR FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA
Componentes de los instrumentos

Fuentes
Teniendo en cuenta que la magnitud de la seal de salida, y por
tanto la sensibilidad, es directamente proporcional a la potencia
de la fuente Po, normalmente se utiliza una lmpara de arco de
xenn o de mercurio.
La lmpara ms corriente para los fluormetros es la lmpara de
arco de mercurio, esta fuente produce lneas muy intensas a
254, 366, 405, 436, 546, 577, 691 y 773 nm. Las lneas
individuales se pueden aislar con los filtros de interferencia o
absorcin adecuados.
Para los espectrofluormetros, en donde se requiere una fuente
de radiacin continua, normalmente se utiliza una lmpara de
INSTRUMENTOS PARA MEDIR FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA
Componentes de los instrumentos

Cubetas o compartimentos para la cubeta


Para medidas de fluorescencia se utilizan tanto cubetas
cilndricas como rectangulares fabricadas con vidrio o con slice.
Se debe tener en cuenta el diseo del compartimiento de la
cubeta para reducir la cantidad de radiacin dispersada que llega
hasta el detector.
Selectores de longitud de onda
La mayora de los espectrofluormetros estn equipados con
monocromadores de red.
Detectores de radiacin
La seal de fluorescencia tpica es de baja intensidad, por tanto
se necesitan factores de amplificacin altos para estas medidas.