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CONTROL MICROBIOLOGICO DE MEDICAMENTOS

TEMA:
- Antibiticos Valoraciones Microbiolgicas

INTEGRANTES:
- Chochoca Vsquez, John.
- Garay Fuertes, Isabel.
- Mera Santa Cruz, Ermitanio.
- Tafur Carranza, Patricia.
- Tirado Enrquez, Fiorella.
- Valle Len, Charlie.
Pruebas y Valoraciones biolgicas:
Antibiticos Valoraciones Microbiolgicas
La potencia o actividad de los antibiticos se calcula comparando
el grado de inhibicin de microorganismos sensibles y especficos
determinada por concentraciones conocidas del antibitico
analizado y una sustancia de referencia.
En los antibiticos puede haber ligeros cambios qumicos que se
traducen en prdida de actividad antimicrobiana que no pueden
demostrarse por mtodos qumicos, por esta razn, en caso de
duda respecto a la actividad de un antibitico, los mtodos de
valoracin microbiolgica prevalecen sobre los mtodos qumicos.
Valoracin microbiolgica de un antibitico
Para valorar microbiolgicamente un antibitico, se pueden emplear dos tcnicas: la valoracin
en cilindro-placa (o en placa) y la valoracin turbidimtrica (o en tubo), ambos comparan la
respuesta del microorganismo de prueba, frente a una Sustancia de referencia (SRef) de
actividad conocida y una muestra tratadas en las mismas condiciones.

Tabla 1 lista de todos los antibiticos que requieren Valoracin microbiolgica.

Antibitico Tipo de Valoracin Antibitico Tipo de Valoracin

Amfotericina B Cilindro - placa Colistimetato Cilindro - placa


Bleomicina Cilindro - placa Colistina Cilindro - placa
Capreomicina Turbidimtrica Dihidroestreptomicina Cilindro - placa
Turbidimtrica
Carbenicilina Cilindro - placa Eritromicina Cilindro - placa
Cloranfenicol Turbidimtrica Gentamicina Cilindro - placa
Clortetraciclina Turbidimtrica Gramicidina Turbidimtrica
Cloxacilina Turbidimtrica Nafcilina Cilindro - placa
Tabla 2 lista de todos los antibiticos que requieren Valoracin microbiolgica.

Antibitico Tipo de Valoracin Antibitico Tipo de Valoracin

Natamicina Cilindro - placa Polimixina B Cilindro - placa


Neomicina Cilindro - placa Sisomicina Cilindro - placa
Turbidimtrica

Novobiocina Cilindro - placa Tetraciclina Turbidimtrica


Nistatina Cilindro - placa Tioestreptona Turbidimtrica
Oxitetraciclina Turbidimtrica Troleandomicina Turbidimtrica
Paromomicina Cilindro - placa Tilosina Turbidimtrica
Penicilina G Cilindro - placa Vancomicina Cilindro-placa

NOTA: Se debe tomar las precauciones de seguridad adecuadas al realizar estas valoraciones debido a las
posibles alergias a los frmacos ya que se utilizan cultivos vivos de microorganismos.
Valoracin de cilindro-placa (o en placa).
Se basa en la difusin del antibitico desde un cilindro vertical, a travs de una superficie
con agar solidificado en un plato o placa de Petri. el crecimiento del microorganismo
especifico inoculado en el agar resulta inhibido en una rea circular o zona en torno al
cilindro que contiene la solucin del antibitico.
Valoracin turbidimtrica (o en tubo).
Se basa en la inhibicin del crecimiento de un microorganismo en una solucin uniforme
del antibitico en un medio fluido que favorece el crecimiento del microorganismo en
ausencia del antibitico.
Unidades y sustancias de referencia.
La potencia de los antibiticos se designa en unidades (U) o en microgramos (g) de
actividad. En un principio, se consideraba que un antibitico seleccionado como sustancia
de referencia constaba en su totalidad de una sola entidad qumica y por lo tanto, se le
asignaba una potencia de 1 000 g/mg. En muchos de estos casos, a medida que los
mtodos de fabricacin y purificacin para ciertos antibiticos avanzaron en su desarrollo,
fue posible obtener antibiticos con ms de 1 000 g de actividad/mg.
CONTROLES QUE SE REALIZAN PARA LAS
VALORACIONES MICROBIOLGICAS
Aparato. El material del laboratorio usado para almacenar y transferir microorganismos de
prueba debe ser estril y estar exento de residuos que pudieran interferir en la valoracin ( ver
limpieza y material de vidrio). Usar un mtodo de esterilizacin validado tal como calor seco,
vapor o irradiacin; o utilizar material del laboratorio estril y desechable.
Control de temperatura. Se requiere control termosttico en varias etapas de una valoracin
microbiolgica: durante el cultivo de un microorganismo y la preparacin de su inculo, as como
durante la incubacin en las valoraciones en placa o tubo.
Microorganismo de prueba. Para asegurar el desempeo aceptable de los microorganismos
de prueba, estos deben almacenarse y conservarse de manera apropiada. Durante la validacin
o verificacin del mtodo se deben establecer las condiciones de almacenamiento especficas.
Si se observa un cambio en las caractersticas morfolgicas y fisiolgicas del microorganismo,
desechar los cultivos.
Almacenamiento prolongado. Para el almacenamiento prolongado, mantener los
microorganismos de prueba en una solucin de almacenamiento adecuada, tal como suero fetal
de ternero al 50%, en caldo glicerol al 10% - 15%, en caldo soya tripticasena, sangre de oveja
desfribinada o en leche descremada. Los cultivos que se almacenan durante periodos
prolongados se recomienda liofilizarlos; se prefieren temperaturas de -60C o inferiores; son
aceptables temperaturas inferiores a -20C.
Cultivos primaros. Preparar los cultivos primarios transfiriendo microorganismos de prueba de los
viales de almacenamiento prolongado a medios apropiados e incubar en condiciones adecuadas.
Almacenar los cultivos primarios a la temperatura apropiada, por lo general a 2 C- 8 C, y desechar
despus de tres semanas. Se puede usar el mismo cultivo primario para preparar los cultivos de
trabajo por un mximo de siete das nicamente.
Cultivos de trabajo. Preparar los cultivos de trabajo transfiriendo el cultivo primario a medios slidos
apropiados para obtener colonias aisladas. Incubar los cultivos de trabajo en condiciones apropiadas
para obtener un crecimiento satisfactorio para la preparacin de los inculos de prueba.
Crecimiento o desempeo no caracterstico de un microorganismo de prueba. Usar cultivos
madre, cultivos primarios o cultivos de trabajo nuevos cuando un microorganismo de prueba presente
crecimiento o desempeo no caracterstico.
Diseos de valoracin. Los diseos experimentales adecuados son clave parra incrementar la
precisin y minimizar el sesgo.
Valoracin en cilindro-placa. Las comparaciones se limitan a las relaciones entre las mediciones
del dimetro de la zona dentro delas placas, sin tener en cuenta la variacin entre placas.
Valoracin turbidimtrica. Para evitar un sesgo sistemtico colocar aleatoriamente tubos
duplicados en gradillas separadas de manera que cada gradilla contenga un conjunto completo de
tratamientos. La valoracin turbidimtrica, debido a la configuracin de las muestras en las gradillas
para tubos de ensayo es sensible a ligeras variaciones de temperatura.
METODO DE CILINDRO - PLACA
Esta tcnica es la ms utilizada dada su exactitud y
sensibilidad; se fundamenta en la difusin del antibitico
desde un cilindro vertical (o desde una perforacin circular
en el agar) a travs de una capa de agar solidificada en una
placa de petri hasta inhibir totalmente el crecimiento del
microorganismo aadido en el medio de cultivo, en un rea
circular o zona de inhibicin entorno al cilindro que contiene
una solucin del antibitico. Las distintas respuestas
obtenidas (dimetros de los halos de inhibicin) son
proporcionales a las dosis de antibitico utilizadas.
METODO TURBIDIMETRICO
Se basa en la inhibicin del crecimiento de un cultivo
de microbiano en una solucin uniforme del antibitico
en un medio lquido que promueva su rpido
crecimiento en ausencia del antibitico.
El mtodo consiste en inocular en un medio adecuado
una suspensin del microorganismo escogido, que
tenga una sensibilidad al antibitico a ser examinado;
tal que se d una inhibicin lo suficientemente grande
en las condiciones del ensayo. Usar una cantidad
conocida de la suspensin escogida; as como obtener
una medida de opacidad leble despus de un periodo
de incubacin cerca de 4 horas.
PREPARACION DEL INOCULO
INCULOS
Suspender el organismo de prueba obtenido de un cultivo reciente en 3 ml de
solucin salina SR estril. Enterococcus hirae y Staphylococcus aureus se cultivan en un
medio liquido no en agar. Espaciar la suspensin salina sobre la superficie de dos o ms
placas de agar (ver tabla 8). Incubar durante el tiempo y a la temperatura o hasta que el
crecimiento sea evidente.

Despus de incubar recolectar el organismo de las placas con aproximadamente 50 ml


de solucin salina SR estril, usando una varilla de vidrio doblada en Angulo estril.
Pipear y transferir la suspensin a un frasco de vidrio estril, esta es la suspensin de
recoleccin.

Determinar durante la verificacin del mtodo la cantidad de suspensin de recoleccin


que se usara como el inoculo, comenzando con el volumen sugerido en la (tabla
8).Preparar tambin una solucin extra como una prueba de crecimiento .

Determinar la duracin exacta


Incubar las pruebas de ensayo durante los tiempos indicados en la ( tabla 11) .Ajustar
de la incubacin, observando el
la cantidad de inculos a diario , si fuera necesario , para obtener la relacin de concentracin
crecimiento.
respuesta optima a partir del organismo de prueba en los tubos . Una vez completados los
periodos de incubacin especficos, los tubos que contienen la mediana de la concentracin
estndar deben presentar los valores de absorbancia especificados en la (tabla9).
Anlisis:
En el da de la valoracin, preparar la concentracin de Agregar los volmenes de las diluciones de prueba del estndar y
antibitico, diluyendo soluciones madre del estndar y de la muestra , distribuir en una gradilla. Agregar el volumen de
de cada una de las muestras, segn se especifica en inoculo especificado en la (tabla 10) a cada tubo en la gradilla , y
soluciones estndar y soluciones de muestra. colocar la gradilla completada en una incubadora a 36,0 - 37,5.
durante el tiempo especifico (tabla11)

Preparar cinco niveles de prueba, cada uno por


triplicado, del estndar y uno solo nivel de prueba,
tambin por triplicado, de hasta 20 muestras Despus de la incubacin , inhibir el crecimiento del
correspondientes a s (mediana de la concentracin) del organismo ,agregando 0,5ml de formaldehido diluido a cada
estndar. tubo ,excepto para tilosina , calentar la gradilla en un bao de
vapor durante 5- 10 minutos y llevar a temperatura ambiente
.Leer la absorbancia o la transmitancia a 530 o 580 nm ,
analizando una gradilla cada vez.
Colocar los tubos en la gradilla para los tubos de
ensayo .incluir en cada gradilla 1-2 tubos de control
que contenga 1 ml del diluyente de prueba (tabla7)
pero sin antibitico
MEDIOS Y SOLUCIONES

Los medios requeridos para la preparacin de los inculos de los organismos de prueba
se preparan con los ingredientes listados en esta seccin .Se permite pequeas
modificaciones de los ingredientes individuales ; asimismo , se pueden usar medios
deshidratados reconstruidos ,siempre que los medios resultantes tengan propiedades de
crecimiento.
Medios : disolver los ingredientes en agua para obtener y ajustar las soluciones con
hidroxido de sodio o acido clorhdrico , segn se requiera , de modo que despus de la
esterilizacin con vapor el PH sea el especificado
TABLAS
SOLUCIONES AMORTIGUADORAS
MEDIOS Y SOLUCIONES PARA
ANTIBITICOS

Preparar los medios de cultivo a partir de mezclas deshidratadas comerciales


siguiendo las indicaciones del fabricante.

Es posible que puedan existir modificaciones ligeras de los ingredientes individuales


o medios reconstituyentes, siempre que no alteren las propiedades del
microorganismo o mejoren la promocin del crecimiento microbiano y den una curva
similar de repuesta estndar.
CALCULOS
La potencia del antibitico se calcula mediante la interpolacin de una recta
estndar o patrn obtenida por transformacin logartmica y ajustada pero
cuadrados mnimos.

La potencia o actividad de los antibiticos se calcula comparando el grado de


inhibicin de microorganismos sensibles y especficos determinada por
concentraciones conocidas del antibitico analizado y una sustancia de referencia.
Las sustancias de referencia empleadas en los ensayos, son sustancias cuya
actividad se ha definido por un organismo reconocido por la autoridad sanitaria
nacional.
Tabla de Inoculacin Patrn Tabla 4 Pag. 1492 USP (XXII) (Medio de Cultivo,
Temperatura, Tiempo, Dilucin, etc.)
Mtodo de Calculo:
Calculo por curva dosis respuesta y formula
Estadstico mediante grficos y regresin
Calculo por curva dosis respuesta
Formula :
Potencia = mg./mg. = Volumen (ml) x Concentracin (mg./ml)
Pesada (mg)
Concentracin debe tenerse en cuenta la composicin del antibitico
La Potencia se determina de la tabla de patrones
Mtodo Estadstico : Se grafica la curva dosis respuesta, de ella estadsticamente por
regresin se determina, el Error, la Varianza, la Regresin y el Intervalo de Confianza
E = Sumatoria de Cuadrados Regresin
CM = Cuadrado Medio
C = E / E S2 x t2
2
S = Cuadrado Medio del Error
c = 4/3 h
h = n preparaciones
M = CM x
I = log segunda dosis log primera dosis
R = antilog. M
Potencia = R x Potencia Supuesta
Concentracin inhibitoria mnima (CIM)

Corresponde a la menor concentracin de antimicrobiano que inhibe el


crecimiento bacteriano luego de 18 a 24 horas de incubacin.

Concentracin bactericida mnima (CBM )

Corresponde a la menor concentracin capaz de matar un 99,9% la


poblacin bacteriana.
DETERMINACION DE
POTENCIA DE MUESTRA
Potencia de muestra desconocida

Promediar las mediciones de la zona


estndar y las mediciones de la zona
de la muestra en las tres placas
usadas.

Corregir por variaciones entre placa, usando el


punto de correccin determinado anteriormente
para obtener un promedio corregido para la
muestra desconocida
Valoracin turbidimtrica

Anlisis de los datos de muestra y la


determinacin de la potencia de una
muestra desconocida usando la
valoracin turdimtrica

El mtodo ,los tubos se distribuye de


forma aleatoria dentro del bloque de
calentamiento u otro dispositivo de control Datos de muestra (valoracin turbidimtrica)
de temperatura.

Si el dispositivo tiene un perfil de La gradilla se divide en reas de


temperatura que no es uniforme, se temperatura relativamente uniforme y en
prefiere un diseo en bloques cada rea se coloca al menos un tubo de
aleatorizados. cada concentracin de estndar y de cada
muestra desconocida.
Datos de muestra (valoracin turbidimtrica)

Paso 1 : Realizar los clculos iniciales y


la verificacin de aptitud de variabilidad.

Paso 2 : Determinar la lnea de la curva


estandar.
Determinacin de potencia de la muestra
Para estimar la potencia de la muestra desconocida, se debe
promediar las 3 mediciones de absorbancia.
Para obtener la potencia de la muestra desconocida, tomar el
antilogaritmo de ----- y multiplicar el resultado por cualquier
factor de dilucin aplicable, el valor que resulte tambin se
puede expresar como porcentaje de la concentracin de
referencia.
LIMITES DE CONFIANZA Y COMBINACIN DE
LOS CLCULOS Y DE LAS VALO0RACIONES
Por la variabilidad que existe entre valoraciones
es necesario 3 o mas determinaciones
independientes. Se comienza con solucin
madre y diluciones de prueba tanto del estndar
como de la muestra prepararlas por separado y
repetir la valoracin de la muestra otro da.
Usar el mtodo del Apndice 2
APENDICE 1. FORMULAS PARA CLCULOS MANUALES DE
REGRESIN Y CONCENTRACIN DE LA MUESTRA

Cuando las concentraciones estn igualmente espaciadas


en la escala logartmica, los clculos se pueden realizar
usando las siguientes formulas
Apendice 2. procedimiento para verificar
valores atpicos; rechazo de medicin atpicas
o aberrantes
Cualquier medicin q se encuentre con falla en el procedimiento de
valoracin deber ser rechazada sin importar en que procedimiento se
encuentre, el no retener alguna medicin con aparente falla procedimental
presentara una fuente de sesgos.
Se puede analizar mediante el criterio siguiente:
Se basa en la variacin dentro de un solo grupo de mediciones
supuestamente equivalentes a partir de una distribucin normal, en
promedio el criterio rechazara una observacin valida una vez cada 25
ensayos o una vez cada 50 ensayos, designar mediciones en orden de
magnitud de (Y1 a YN).