CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA: CONTROLE DA TRANSCRIÇÃO

- Níveis de Controle da Expressão Gênica:

- Embora todas as etapas envolvidas na expressão gênica possam ser reguladas, para a maioria dos genes a iniciação da transcrição é o ponto mais importante de controle. - A transcrição de genes é ligada ou desligada nas células por proteínas reguladoras, que se ligam em seqüências de DNA, chamadas seqüências reguladoras de DNA. - Embora cada proteína reguladora tenha características únicas, a maioria liga-se ao DNA usando um pequeno número de motivos da estrutura da proteína.

- A seqüência exata de aminoácidos que é dobrada no motivo determina a seqüência particular de DNA que é reconhecida.

Procariotos: Procariotos
- Resposta direta às condições externas (proteínas induzidas); Nível basal de transcrição se encontra num estado ativado - genes ON - Organização do genoma em unidades de expressão gênica - operons (promotor, operador e genes estruturais metabolicamente relacionados); - As proteínas reguladoras geralmente ligam-se a seqüências reguladoras no DNA, próximas ao sítio de ligação da RNA-polimerase e ativam ou reprimem a transcrição do gene. - Possuem 1 única RNA-polimerase, composta de 5 subunidades principais (holoenzima E2FF´W), onde:
E: ligação ao promotor; F: ligação ao nucleotídeo; F´: ligação ao molde; W: reconhecimento preciso do promotor e iniciação da transcrição. W70: reconhece promotores dos genes housekeeping de E. coli

- Promotores upstream indicam exatamente onde a síntese de RNA deve ser iniciada: - TATA Box (TATAAT: -10) - TTGACA (-35)

Eucariotos: Eucariotos
- A transcrição em eucariotos é muito semelhante à de procariotos e envolve as etapas de iniciação, alongamento e terminação. - Controle é mais complexo: não há resposta direta às condições externas (exceção: células do fígado); - Nível basal de transcrição se encontra num estado reprimido - genes OFF - Cada unidade de transcrição contém, geralmente, um único gene; - Apresentam, pelo menos, cinco RNA-polimerases envolvidas na síntese de RNA·s específicos: diferentes,

1) RNA-P I: síntese de pré-rRNA·s que originam os rRNA·s 18S, 5,8S e 28S; 2) RNA-P II: hnRNA·s e alguns snRNA·s; 3) RNA-P III: tRNA·s, rRNA 5S, RNA 7S e alguns snRNA·s; 4) RNA-P mitocondrial 5) RNA-P de cloroplasto

- As RNA-pols eucarióticas não são capazes de iniciar a transcrição de uma maneira precisa. - Elas necessitam de muitas proteínas acessórias, específicas para cada tipo de RNA-pol. - Essas proteínas são chamadas de FATORES DE TRANSCRIÇÃO

- Em eucariotos, as seqüências reguladoras de DNA são freqüentemente separadas do promotor por muitos milhares de pares de bases de nucleotídeos.

- A iniciação da transcrição, em eucariotos, deve levar em conta a compactação do DNA nos nucleossomos e formas mais compactas de estrutura da cromatina.

- Em eucariotos, a expressão de um gene é, geralmente, controlada pela combinação de proteínas reguladoras de genes.

- As proteínas reguladoras de genes eucarióticos atuam afetando o processo de montagem, aumentando a sua velocidade (para ativadores) e diminuindo (para repressores).

Aparato de transcrição
- Subdividido em três grupos: A) Subunidades da RNA-polimerase que não são específicas para promotores individuais; B) Fatores gerais de transcrição: são necessários para iniciar a transcrição e são específicos para as diferentes classes de genes; C) Fatores de transcrição específicos: se ligam a seqüências específicas de promotores alvos, ativando ou reprimindo a transcrição. Características dos Fatores de Transcrição: - apresentar seqüências (motivos estruturais) que reconhecem e se ligam a seqüências reguladoras do gene; - apresentar seqüências para interação com outras proteínas para realizar a sua função. - TBP (TATA-binding protein): quando associada com diferentes TAFs (fatores associados à TBP) forma diferentes complexos, que são os fatores de transcrição gerais. - Para cada classe de genes existem fatores de transcrição gerais característicos, bem como um mecanismo de montagem desse aparato específico para cada classe.

Transcrição de genes de classe I
- Os genes de rRNA estão organizados em agrupamentos com 100 a 5000 repetições (no nucléolo). Existem 40.000 moléculas de RNA-pol I por célula e 50 moléculas de cada rRNA podem ser transcritas simultaneamente. Durante a divisão celular existem em torno de 10 milhões de cópias de rRNA. - O promotor desses genes está localizado bem próximo ao sítio de início de transcrição, na região espaçadora não-transcrita - Os FATORES DE TRANSCRIÇÃO gerais para essa classe são UBF e SL1 (que é um complexo formado por TBP + TAF110, TAF63 e TAF 48). - SL1 forma uma ponte entre UBF e a RNA-pol I, formando um complexo de ligação ao DNA, crítico para a iniciação da transcrição. - Além desses fatores, existem outros, como TFIA, TFIC, TFID e TFI-F.

Transcription from tandemly arranged rRNA genes, as visualized in the electron microscope

An idealized transcription unit. The drawing illustrates how the electron microscope appearance demonstrates the direction of transcription, as well as the start site of the unit

The processing of a 45S rRNA precursor molecule into three separate ribosomal RNAs. Nearly half of the nucleotide sequences in the primary RNA transcript are degraded in the nucleus

Initiation of rDNA transcription Two transcription factors, UBF and SL1, bind cooperatively to the rDNA promoter and recruit RNA polymerase I to form an initiation complex. One subunit of SL1 is the TATAbinding protein (TBP).

Transcrição de genes de classe II
- Pertencem a essa classe os genes que codificam RNA heterogêneo nuclear (mRNA) e alguns dos pequenos RNAs nucleares (snRNA). - Os promotores típicos de genes de classe II localizam-se a montante do sítio de iniciação da transcrição: TATA box: tipicamente na posição ²30, onde se liga o complexo TFIID, responsável pela determinação do sítio de iniciação da transcrição. CAAT box: onde se liga o fator CTF (CAAT box transcription factor) ² GGNCAATCT. GC box: onde se liga o fator SP1 e pode ter várias cópias a montante do TATA box e funciona em ambas as orientações ² GGGCGG. É um fator seqüência-específico. - TFIID: é o complexo de ligação ao DNA, sítio-específico, composto por TBP + 9 TAFs. Ele é o alvo para a ativação de proteínas reguladoras no complexo de iniciação. - Além desse, outros complexos também são requeridos para a iniciação em todos os promotores: TFIIA, TFIIB, TFIIC, TFIIE, TFIIF e TFIIH. Esses fatores são necessários mesmo para promotores que não possuem o TATA box.

Montagem do complexo de iniciação de genes de classe II
1) Reconhecimento do promotor por TFIID; 2) Reconhecimento do complexo promotor-TFIID por TFIIB; 3) Recrutamento do complexo TFIIF/RNA-pol II; 4) Ligação de TFIIE e TFIIH ao complexo de pré-iniciação; 5) Separação das fitas na região do promotor e formação do complexo aberto de iniciação; 6) Formação da primeira ligação fosfodiéster do RNA que está sendo transcrito; 7) Liberação dos contatos da RNA-pol II com o promotor (liberação do promotor); 8) Alongamento do transcrito de RNA. TFIIA pode se juntar ao complexo a qualquer momento depois da ligação de TFIID, servindo para estabilizar o complexo de iniciação, talvez deslocando um inibidor associado à TFIID.

Funções dos complexos TFII
- TFIID: coordena a montagem ordenada dos outros fatores de transcrição geral; - TFIIB: interage com o complexo TFIID-promotor, recrutando, seletivamente, a RNA-pol II associada com TFIIF; - TFIIF: evita a ligação não-seletiva da RNA-pol II no DNA livre (~ ao fator W bacteriano); - TFIIH: possui atividade de helicase, desenrolando a hélice do DNA no sítio de iniciação e possui atividade de quinase, fosforilando a porção C-terminal da RNA-pol II, necessário para a liberação da enzima do promotor; - A RNA-pol II existe sob duas formas: IIa é a não-fosforilada, que se associa à TFIIF e junta-se ao complexo; e IIo é a que possui a extremidade C altamente fosforilada, necessária para o alongamento da cadeia de RNA. Por isso, a fosforilação ocorre durante o processo de iniciação, estimulando a liberação da RNA-pol II do promotor; - TFIIE e TFIIF possuem atividade de ATPase, gerando, através de hidrólise de ATP, um complexo de transcrição ativado, com energia para a formação da primeira ligação fosfodiéster.

Stepwise assembly of a transcription-initiation complex from isolated RNA polymerase II (Pol II) and general transcription factors. Once the complete transcription-initiation complex has assembled, separation of the DNA strands at the start site to form an open-complex requires ATP hydrolysis. As transcription initiates and the polymerase transcribes away from the promoter, the CTD becomes phosphorylated and the general transcription factors dissociate from the TBP-promoter complex. Numerous other proteins participate in transcription initiation in vivo.

Transcrição de genes de classe III
- Pertencem a essa classe os genes que codificam tRNA, rRNA 5S, U6 snRNA e 7SRNA. - Existem dois modelos diferentes de promotores nesta classe, classificados de acordo com a localização das seqüências ativadoras: Promotores a montante: possuem TATA box, p. ex. gene U6 e 7SK; Promotores a jusante: as seqüências reguladoras estão dentro da região transcrita do gene: regiões de controle interno (ICRs): box A, B e C.

- Os fatores gerais de transcrição para os promotores a jusante são TFIIIB e TFIIIC, sendo que o rRNA 5S requer um fator adicional, TFIIIA, que é específico para esse gene. - TFIIIB é o complexo composto por TBP + TAF172 e TAFL, em mamíferos.

Montagem do complexo de iniciação de genes de classe III
A) Para tRNA: -TFIIIC se liga diretamente ao DNA nos box A e B. Deve ser funcionalmente equivalente a reguladores seqüência-específicos, como SP1 na RNA-pol II e UBF na RNA-pol I. -TFIIIB reconhece o complexo, ligando-se a este, recrutando a RNA-pol III, formando o complexo ativo. B) Para rRNA 5S: - TFIIIA se liga nas seqüências bloco C, IE e bloco A; - TFIIIC reconhece o complexo e se liga à TFIIIA e ao DNA, recrutando o complexo TFIIIB e posteriormente a RNA-pol III, que reconhece TFIIIB, formando um complexo capaz de iniciar e ativar a transcrição. C) Para genes com promotores a montante, p. ex. U6snRNA e 7SK: - Organização semelhante aos genes de classe II: TATA box na posição ²30, elemento proximal upstream (PSE) em ²60. - Combinação dos diferentes fatores de transcrição requeridos para a transcrição dos genes de tRNA.

Transcription of polymerase III genes The promoters of 5S rRNA and tRNA genes are downstream of the transcrip-tion initiation site. Transcription of the 5S rRNA gene is initiated by the binding of TFIIIA, followed by the binding of TFIIIC, TFIIIB, and the polymerase. The tRNA promoters do not contain a binding site for TFIIIA, and TFIIIA is not required for their transcription. Instead, TFIIIC initiates the transcription of tRNA genes by binding to promoter sequences, followed by the association of TFIIIB and polymerase. The TATA-binding protein (TBP) is a subunit of TFIIIB.

Regulação da atividade dos fatores de transcrição

- A maioria dos genes eucarióticos é transcrita em um nível muito baixo, a menos que a transcrição seja estimulada por um ou mais ativadores transcricionais.

- Tipicamente, esses ativadores reconhecem elementos específicos, localizados a montante do sítio de iniciação.

de

DNA

- Os ativadores estimulam a taxa de montagem de complexo de transcrição ou a fração funcional do complexo que interage no promotor em um determinado período.

Reguladores negativos da expressão gênica poderiam inibir a transcrição, interferindo em alguma etapa da via de início da transcrição, bloqueando a ativação desta. - A função dos ativadores pode ser afetada em muitos níveis, tais como a localização nuclear, evitando a formação de um ativador ativo, a ligação ao DNA ou afetando a capacidade para estimular a transcrição, uma vez ligado ao DNA. - Outros reguladores negativos podem afetar a própria maquinaria de transcrição geral, evitando a formação do complexo de pré-iniciação funcional, onde, p. ex., o repressor poderia esconder o promotor do aparato de transcrição

Repressores tardios, que agem nas vias finais da iniciação, devem ser utilizados em genes que necessitam uma rápida indução em resposta a um estímulo comportamental

TBP: TATA binding protein
- Proteína que se liga ao elemento de consenso TATA ou seqüências relacionadas. Fator de transcrição geral, primordial para o início da transcrição em todas as classes de genes: Classe I: SL1 Classe II: TFIID Classe III: TFIIIB - As TAFs conferem especificidade aos diferentes complexos formados com TBP. São alvos para proteínas reguladoras ativarem a transcrição - A maioria dos eucariotos possui somente uma cópia do gene que codifica a TBP. Arabdopsis thaliana e o milho são exceções, com duas cópias do gene. -O tamanho da proteína varia de 22 kDa (Arabdopsis) a 38 kDa (homem, - Drosophila).

- A região C-terminal, com 180 aác., apresenta pelo menos 80% de identidade em TODOS os organismos estudados. - Essa região contém 2 repetições de aác, chamadas de repetidos diretos, que interagem com o DNA no TATA box, e que flanqueiam uma região básica, chamada de repetido básico, que interage com proteínas.

- A região N-terminal das TBPs de diferentes espécies varia de tamanho e composição de aác.: 18 em Arabdopsis e 159 no homem. Em leveduras, essa região não tem função alguma. No homem, está envolvida em mediar interações entre fatores reguladores.

Structure of the conserved C-terminal domain of TBP bound to TATA-box DNA. Although TBP is a monomer, the polypeptide backbone of this domain is folded into a conformation that has an approximate twofold symmetry. However, the surface residues of the protein clearly distinguish the two halves. TBP binds to the minor groove of TATA-box DNA, distorting the normal duplex structure and bending the DNA dramatically.

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