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LIC TM ROSY GOMEZ LEIVA

n.gomez.lab@gmail.com
INMUNOHISTOQUIMICA

La inmunohistoquímica (IHC) es
un método para detectar la
ubicación de proteínas y otros
antígenos en secciones de tejido
usando anticuerpos. Aunque es
menos cuantitativo que otros
inmunoensayos tales como
Western blot o ELISA, el IHC
muestra donde las proteínas se
expresan en el contexto de tejido
intacto.
• La clave para la tinción inmunohistoquímica de
alta calidad es la especificidad del anticuerpo
usado.
• Un anticuerpo altamente específico se unirá sólo
a la proteína de interés en la sección de tejido.
• La interacción anticuerpo-antígeno se visualiza
utilizando detección cromogénica o fluorescente.
• En la detección cromogénica, el anticuerpo se
conjuga con una enzima que escinde un sustrato
para producir un precipitado coloreado en la
ubicación de la proteína.
• En la detección fluorescente, el anticuerpo se
conjuga con un fluoróforo que puede ser
visualizado usando microscopía de fluorescencia.
LA ESTRUCTURA DE UN TEJIDO DEPENDE FUNDAMENTALMENTE
DE LA CONFIGURACIÓN Y CONTENIDO DE LAS PROTEÍNAS
EXISTENTES:

- Lipoproteínas existentes en las


membranas celulares
- Los ácidos nucleícos asociados a
nucleoproteínas
- Proteínas globulares y
fibrilares en el citoplasma
- Glicoproteínas mucosas y
estructurales
- Glicoproteínas fibrosas
extracelulares
CALIDAD DE La fijación evita la autólisis y la necrosis de los tejidos
extirpados, preserva la antigenicidad, y ayuda a

LA MUESTRA
preservar los elementos celulares durante el
procesamiento del tejido.
El fijador utilizado está influenciado por el antígeno
diana así como la técnica de detección deseada
(fluorescente o cromogénica).
Para una adecuada IHQ tambien se
consideran todos los pasos del La inclusión es importante para preservar la morfología
procesos de histotecnología del tejido y dar el soporte del tejido durante la sección
(microtomía).
FIJACION Algunos epítopos pueden no sobrevivir a la fijación dura
o la inclusión.
DESHIDRATACION Durante la sección, el tejido se corta típicamente en
secciones delgadas (3-5μm)para facilitar el estudio.
ACLARAMIENTO

INCLUSION

CORTE
FIJACIÓN
Se utiliza al 10% v/v a pH 7,0 (formol tamponado neutro). Esto se prepara añadiendo 10ml de
la solución de formol (como lo vende el fabricante) a 90 ml de úna solución tamponada (fosfato de
Sorensen) a pH 7. A pH neutro la mayoría de los grupos aminos y amidos de los aminoácidos básicos,
son muy reactivos con el formaldehído. A pH básico son aminoácidos como la alanina los más
reactivos.
La muestra hay que introducirla lo antes posible en el fijador.
La relación de volumen entre muestra a fijar y fijador debe ser de 1:20 como mínimo.
La muestra a fijar no debe ser muy gruesa, pues de lo contrario las zonas centrales no se
fijaran bien.
El formol fija en 24h una muestra de un grosor de 3-5 mm .
El tiempo de fijación es variable, dependiendo, fundamentalmente de las dimensiones de la
muestra a fijar. Muestras pequeñas no más de 8 horas. Muestras grandes no más de 24 horas.
Repercusiones de la acción
fijadora del formol
-La fijación es un punto crucial para conseguir una buena morfología y unos
resultados fiables en la demostración molecular.
-Llegar a un tiempo óptimo es importante (Un ”exceso” de fijación, bueno para la
morfología, puede interferir la demostración de moléculas)
-Las proteínas se pueden demostrar tras fijación en formol por métodos
inmunohistoquímicos, tras recuperación antigénica, pero no se puede demostrar
actividad enzimática y tenemos que hacer congelación.
- Los ácidos nucleicos (ADN, ARN). ADN se puede demostrar tras fijación en
formol, pero para ARN tenemos que hacer congelación
-Los lípidos, grasas neutras se pierden en su mayor parte, tras la fijación en
formaldehído, por el procesado posterior previo a la inclusión en parafina
La fijación,desde el punto de vista de la
Inmunohistoquímica, tiene que conseguir un
compromiso entre las condiciones para obtener
una morfología adecuada y la necesidad de
respetar los lugares antigénicos de las moléculas
que pretendemos demostrar.
1) "la formación de reticulaciones
extensas mediante fijación reduce la
penetración del anticuerpo primario al
objetivo antígeno",
Se sugiere que puede
haber por lo menos tres 2) "la reacción del formaldehído con el
maneras por las cuales el epítopo objetivo reduce la
formaldehído puede inmunoreactividad",
reducir la detección 3) "la reacción con formaldehído (del
inmunológica de los antígeno) provoca cambios en la
epítopos de las proteínas. estructura secundaria de la proteína y se
Éstas incluyen reduce la inmunoreactividad".
Otras posibilidades. Estos incluyen el bloqueo del acceso
del sistema de detección secundario al anticuerpo
primario mediante cambios estructurales tras la fijación
por aldehídos.
TERMINOLOGIA • Antígeno: molécula ajena o tóxica para el
organismo.
• Anticuerpo: proteína de defensa producida
por el mismo organismo.
• Epítopo: region del antígeno reconocida por
el anticuerpo.
• Paratopo: region del anticuerpo reconocida
por el antígeno.
• Monoclonal: descendiente de una sola y
única célula madre.
• Policlonal:descendiente de diferentes líneas
celulares.
• Sensibilidad ?
• Especificidad ?
La Inmunohistoquímica (IHQ) es un estudio histopatológico que se basa en la
utilización de un anticuerpo específico, previamente marcado mediante un
enlace químico con una enzima que puede transformar un sustrato en visible,
sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el
antígeno.
Proceso (protocolo típico)

• DESPARAFINIZACION
• HIDRATACION
• RECUPERACION ANTIGENICA
• BLOQUEO DE LA PEROXIDASA
• ANTICUERPO PRIMARIO
• POLIMERO
• CROMOGENO
• CONTRASTE
RECUPERACION DE ANTIGENO
La recuperación de EPÍTOPO inducida por CALOR se realiza más
a menudo utilizando una olla a presión, un microondas o BAÑO
MARIA (60 ° C) e incuban los portaobjetos en solución de
recuperación.
A menos que el método de recuperación de antígeno se indique
en la hoja de datos de anticuerpos, el método óptimo para cada
antígeno debe ser encontrado experimentalmente.
Esto se aplica también a la elección del tampón utilizado para la
recuperación mediada por calor.
Los tampones más comúnmente usados son citrato de sodio 10
mM pH 6, Tris-EDTA pH 9 y EDTA pH 8. Se recomienda probar
varios métodos para encontrar el método de recuperación que
da una tinción óptima.
Recuperación de antígeno: el proceso
de fijar los tejidos puede ocultar o
alterar los epítopes de las moleculas
1. Técnicas: químicas o enzimáticas
2. Químicas:
• Depende de amortiguador
• pH bajo: citrato pH 6.0
• alto pH: EDTA pH 9.0
• Técnica de aplicación: incubación, olla de presión, vapor…
3. Enzimaticas: tripsina, proteinasa K…
En el desenmascaramiento con calor
el pH de la solución de reactivación es A
determinante para reconstituir los
antígenos.

A = algunas moléculas se reactivan


con pH entre 1 y 10 B C

B = otros antígenos muestran una


reducción del desenmascaramiento si
realizado con pH entre 3 y 6.

C = para otras moléculas la


recuperación aumenta
incrementando el pH pH 2 3 4 5 6 7 10
Algunos antígenos necesitan de un pH 7 para reactivarse. De lo
contrario la reactivación no si realiza y se origina un falso negativo.

MALToma
Gastrico – CD21

pH 6.0 pH 9.0
Otros antígenos se reactivan usando
solamente una solución alcalina.

MALToma de pulmón
CD 43

pH 6.0 pH 9.0
La mayoría de los antígenos pueden
desenmascararse con solución de pH 1.0 a pH
10.0.

Linfoma folicular
CD 20

pH 6.0 pH 9.0
El desenmascaramiento del Ki67, de los receptores
para el estrógeno y de la progesterona disminuye
bajando el pH de 6 a 3.

HIER Buffer citrato

ER – pH 6 ER – pH 3
También la molaridad de la solución de reactivación
puede influir en el desenmascaramiento de los
antígenos.

Mama
Carcinoma lobulillar

ER citoplasma ER núcleo
Hay antígenos que se reactivan en forma mejor solamente utilizando una solución
de EDTA.

Mesotelioma
Calretinina

EDTA Citrato
Falsos negativos pueden originar por realizar el desenmascaramiento al calor por un tiempo
corto o con una temperatura inadecuada.

Falso negativo Recuperación del antígeno


De lo contrario, un desenmascaramiento
por un tiempo largo y/o con
temperatura demasiada alta puede
originar un falso positivo por crear
antígeno quiméricos.

Falso positivo

Además un desenmascaramiento por tiempo


largo y alta temperatura puede favorecer la
activación de biotina endógena o de
moléculas semejantes que originan falsos
positivos si se usa el sistema de avidina-
biotina.
El uso de un buffer inadecuado para la reacción inmunohistoquímica puede influir en el vinculo del
anticuerpo al antígeno o incrementar el fondo de la inmunotinción.

Tris PBS
BLOQUEO DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA ENDOGENA

Se inhibe su actividad por la incubación de secciones con


metanol absoluto que contenga peróxido de hidrogeno
al 3%, de 10-30 minutos a temperatura ambiente.

BLOQUEO DE LA TINCION DE FONDO


• Tinción de fondo especifica
• Tinción de fondo inespecífica
Tinción de fondo especifica
• Presencia de Ag en lugares distintos a aquel en que se quiere
detectar.
• El antisuero contenga Ac contra Ag distintos al que se quiere
determinar .

Tinción de fondo inespecífica


Se forma unión no inmunológica del antisuero a ciertos
componentes del tejido, ejemplo: colágeno.

Se evita usando antisuero primario en diluciones muy altas .


FIN