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Biologia Molecular

Impressão digital de DNA

Prof. Dr. Maximiliano Zierer


Professor Adjunto
Departamento de Bioquímica e Farmacologia
Centro de Ciências da Saúde – UFPI
Introdução
 Impressão digital de DNA:
 É também conhecida como padrão polimórfico ou perfil de DNA
ou, ainda, DNA fingerprint.
 Essa técnica tem utilidade nas mais variadas áreas da
atualidade.
 Freqüentemente, os padrões polimórficos de DNA são utilizados:
 Reconhecimento de paternidade;
 Casos criminais;
 Estudos evolucionários;
 Avaliação de biodiversidade;
 Mapeamento de genes;
 Testes genéticos;
 Reconhecimento de cadáveres;
 Etc...
Introdução
 A impressão digital de DNA é baseada em marcadores
moleculares.

 São fragmentos de DNA que permitem a distinção de indivíduos


geneticamente diferentes.

 Os primeiros marcadores moleculares a serem utilizados foram


os fragmentos produzidos pela digestão do DNA com enzimas
de restrição.

 A variação do tamanho dos fragmentos obtidos de diferentes


indivíduos deu origem à classe de marcadores denominada
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).
Marcadores RFLP
 Desenvolvido por Alec Jeffreys na Inglaterra no início
dos anos 80.
 Este processo é baseado no fato de que a distância
entre os sítios de restrição no DNA difere entre os
indivíduos.
 Os sítios de restrição de um determinado indivíduo são
como uma impressão digital, pois permitem a
identificação de forma precisa e inequívoca do indivíduo.
 Se o DNA de dois indivíduos for cortado com uma
mesma enzima, obtêm-se dois padrões de
fragmentação do DNA, que são distinguíveis pela
variação no comprimento dos fragmentos gerados.
Marcadores RFLP
 Cada padrão de
fragmentos é único de
cada indivíduo, a exemplo
de uma impressão digital.

 A ocorrência de muitos
padrões de fragmentos
com diferentes
comprimentos é
denominada polimorfismo
de comprimento de
fragmentos de restrição
ou simplesmente RFLP.
Marcadores RFLP
 Procedimentos para obtenção de RFLP:
 Isolar o DNA de um indivíduo;

 Digestão com enzimas de restrição;

 Eletroforese em gel de agarose;

 Transferência para um suporte sólido (membrana);

 Hibridização com sondas radioativas;

 Sensibilização de filme radiográfico (autoradiograma).


Marcadores RFLP

(a) O primeiro íntron do gene da


mioglobina tem 4 seqüências
repetidas, as quais contêm 13 pb. Esse
“motivo” é encontrado em outros
locus, marcados com VNTR I, II, e III.

(b) O esquema mostra o número de


repetições dos 3 loci VNTR com a
seqüência “motivo”. Após o Southern
blot obteve-se o seguinte padrão dos
três indivíduos.
Marcadores RAPD
 Dois grupos de pesquisadores propuseram em 1990,
independentemente, o uso de pequenos iniciadores
aleatórios na reação em cadeia da polimerase (PCR)
como método de geração de marcadores moleculares
polimórficos.

 Essa técnica, conhecida como RAPD (Random


Amplified Polymorphic DNA), utiliza um oligonucleotídeo
sintético como iniciador do processo de amplificação,
que produz um polimorfismo detectado pela presença ou
ausência de bandas discretas de DNA.
Marcadores RAPD
 A técnica de RAPD é mais simples e mais rápida que a
do RFLP.
 Ela requer menores quantidades de DNA;
 Não envolve o uso de sondas radioativas;
 Demanda menos mão-de-obra;

 Tem sido utilizada com sucesso principalmente em


espécies vegetais, pois não detecta muita variação na
espécie humana e muitos outros animais.
Marcadores RAPD
 Procedimentos:
 Extração do DNA dos indivíduos a serem analisados;
 Realização da reação de amplificação;
 Utilizando um iniciador de polimerização do DNA diferente de
cada vez;
 Um produto de amplificação é gerado para cada região
cromossômica flanqueada por um par de sítios de iniciação.
 Os fragmentos amplificados são separados por eletroforese em
um gel de agarose;
 Diferentes indivíduos produzem distintos padrões de fragmentos
amplificados.
Técnica do RAPD
DNA na prática forense
 O método de identificação individual molecular
(impressão digital de DNA - RFLP) tem contribuído
muito para soluções de casos forenses.
 O primeiro caso de grande repercussão do uso de DNA
como evidência criminal ocorreu em 1986 na Inglaterra,
com a exoneração de um suspeito de homicídio após
análise de evidências de DNA coletadas na cena do
crime e comparadas com o DNA do acusado.

 A partir de 1987, o FBI e vários laboratórios de


criminalística passaram a utilizar os marcadores de
DNA.
DNA na prática forense
 Amostras de sangue, saliva, pêlos, sêmen, etc.
encontrados na cena do crime passaram a ser
considerados evidencias contundentes e até mesmo
utilizadas como instrumento de prova.

 Portanto, o perfil de DNA é uma simples e rápida


maneira de se compararem seqüências de dois ou mais
indivíduos.
Análise do DNA mitocondrial
 As células possuem grande número de mitocôndrias;

 A variabilidade dos perfis de DNA mitocondrial é


substancialmente menor, uma vez que essa organela é
de origem materna;

 É muito utilizado nos teste de:


 Paternidade;
 Identificação de indivíduos e corpos;
 Estudos de filogenia.
Testes de paternidade
 O teste de DNA é a mais precisa e confiável tecnologia
disponível para identificação de paternidade.
 Normalmente, quando se deseja a identificação de um dos pais
de um indivíduo, faz a análise do DNA do suposto pai, da mãe e
do filho.
 O laudo de um teste de paternidade deve claramente
relatar uma destas duas alternativas:
 O indivíduo testado está excluído e, portanto, não pode ser o pai
biológico em questão.
 O indivíduo testado não está excluído da possibilidade de ser o
pai biológico em questão.
 A estatística no laudo estabelece com qual probabilidade o indivíduo
pode ser o pai biológico do filho considerado.
Precisão dos testes
 Os testes podem provar com 100% de certeza que um
indivíduo não é o pai biológico de uma criança.

 No entanto, não existe ainda nenhum teste que prove


com 100% de certeza que um indivíduo seja o pai
biológico da criança (99,9%).

 Situação que podem resultar em menor precisão:


 Casamentos inter-raciais ou populações não padronizadas;
 Pai biológico é parente do suposto pai;