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Avaliação por citometria de fluxo da produção de citocinas em crianças desnutridas

Leonor Rodríguez, Cristina González, Luis Flores, Luis Jiménez-Zamudio, Jaime Graniel e Rocío Ortiz. CLINICAL AND DIAGNOSTIC LABORATORY IMMUNOLOGY, Apr. 2005, p. 502 507. Seminário: Natasha P. Xavier

Introdução Desnutrição em crianças: .o risco de infecção e morte . .Acomete mais de ¼ das cçs 5 anos em países em desenvolvimento .Estudos epidemiológicos: associação entre desnutrição e infecção .Está entre as maiores causas de morte no mundo .Severidade da desnutrição determina o risco de morte e/ou a severidade das infecções.

e IL-13 e são envolvidas em doenças alérgicas e na defesa às infecções parasíticas . a produção de citocinas e a habilidade dos linfócitos responderem apropriadamente as citocinas. . IL-6. . -Th2 produzem IL-4. . . IL-5.Th1 e Th2 amplificam e dão forma às RI que mediam a proteção durante a doença infecciosa.A caracterização de respostas da cel T (Th1 e Th2) é importante porque fornece uma base para compreender como as cels T contribuem para a resistência ou susceptibilidade às diferentes infecções.Desnutrição q função da cel T. IL-10. -Divisão de linfócitos T CD4: -Th1 produzem IL-2.-Múltiplas anormalidades na RI estão ligadas a DPE. IFN -gama. e TNF-alfa e mediam a imunidade aos patógenos virais e bacterianos.

IL-4 e IL-10) nas células CD4+ e CD8+ e na habilidade destas células de serem ativadas (indicado pela expressão de CD69 e de CD25). IFN-gama. .Objetivo Avaliar por citometria de fluxo os efeitos da desnutrição na produção das citocinas (IL-2.

Materiais e métodos Indivíduos: .

As células foram cultivadas por 5 h a 37°C e 5 % de CO2 em RPMI 1640. PerCP²anti-CD8. Após a incubação. PE²anti-CD25. ambiente. Antígenos da superfície da célula: Coloração específica das moléculas de superfície celulares foi executado com o anti-humano CD4-PerCP ou CD8-PerCP. 100 mcl de suspensão de células incubado com 10 mcl de um anticorpo fluorescente por 30 min em temp. . aloficocianina ²anti-IL-10. Foram estimuladas (phorbol 12-myristate 13-acetate e ionomycin na presença do brefeldin A). as céls foram lavadas com 1% de albumina sérica bovina em solução salina tamponada com fosfato. FITC²anti-IFN-gama. As culturas ativadas foram separadas por coloração. ficoeritrina (PE)²anti-IL-4. isotiocianato de fluoresceína (FITC)²anti-IL-2.Anticorpos: Proteína peridinina clorofila (PerCP)²anti-CD4. e aloficocianina²anti-CD69. Preparação da célula e cultura in vitro: O sangue foi preparado para a estimulação de citocinas.

quatro citometrias coloridas foram realizadas. Após mais incubação.. reparadas no paraformaldeído a 1% antes da análise. . em temp. ambiente. finalmente. as amostras foram centrifugadas e tratadas com solução fluorescente por 10 min. as células foram lavadas e.05 foram consideradas significativas. As amostras foram lavadas e incubadas com os anticorpos anti-citocinas fluorescentes por 30 min. As diferenças entre grupos foram analisadas usando o teste de Mann-Whitney. Citometria de fluxo Após a fixação. uma solução de lise (fluorescente) foi adicionado a cada tubo. Análise estatística MA e EP.Deteção de citocinas intracelulares: Após o antígeno de superfície da célula aparecer. Após a incubação. Diferenças com valores de p 0.

.Resultados % de células CD4+ positivas para IL-2 e IFN-gama.

A % de cels positivas IL-10 foi signif.CD4+ A % de cels positivas IL-4 foi menor em desnutridas. superior no grupo de desnutridas. mas sem diferença estatística significante. .

.Diminuição na produção de citocinas de tipo 1 foi observado nas cels CD8+ de cçs desnutridas.

o n° de céls marcadas expressando IL-4 excedeu o n° de cels expressando IFN²gama.Alteração no equilíbrio relacionado a desnutrição. das citocinas de resposta tipo 1 e 2 . A % de CD8+ prod. Observou-se também: . . . mas a diferença não foi significante. IL-10 foi superior em desnutridas. IL-4 foi maior em desnutridos.A % de CD8+ prod.No grupo de desnutridas.Houve q Produção IFN-gama em desnutridos.

. ..IFs das céls CD25+ foram significativamente mais elevados em nutridos e nutridos/infectados do que em desnutridos/infectados.O nível de expressão. indicado pela intensidade fluorescente(IF). dos marcadores de ativação CD69 e CD25 foi analisado.

elas estavam claramente mais elevadas em nutridos e nutridos/infectados.-Quando as IFs das cels CD69+ foram comparadas . .Ficou claro que as cçs desnutridas mostraram uma resposta de ativação danificada. .

CD4+ e CD8+ de desnutridos: q citocinas tipo 1 (IL-2 e IFN-gama) e o produção de citocina tipo 2 (IL-4 e IL-10). .Discussão .

.Linfócitos incapazes de secretar quantidades normais de citocinas ou de obter função imunológica adequada e a fisiologia alterada dos linfócitos pode estar relacionada principalmente ao dano da RI. .Desnutridos: q proporção de cels de memória (CD45RO+). .q cels (IL-2) é associada com uma q cels CD45RO+ (IL-2).-Outros estudos: Desnutridos: .

-Dados deste estudo: .IL-2 estimula a produção de IFN-gama. Induz diferenciação e ativação de monócitos e macrófagos e melhora suas funções microbicidas. . .q IL-2 e q IFN-gama (CD4+ e CD8+) em desnutridos: o suscetibilidade a infecções. e a expressão reduzida de IL-2 também inibe a síntese de IFN-gama.IFN ² gama é uma citocina chave no desenvolvimento da RI tipo 1. a qual é requerida na eliminação de patógenos. .

IL-10: -fator de supressão para a resposta tipo 1. o IL-4 pode contribuir para q RI. supressão da secreção de IL-2 e de IFN-gama. -Estudo prévio: quando cels T CD8+ estão ativadas na presença de IL-4 elas perdem sua função citotóxica.. . . A produção freqüente e/ou prolongada de IL-4 poderia contribuir para o Ig reportado em cçs desnutridas.o % CD4+ e CD8+ expressando IL-10 foi evidente em desnutridos. . .As porcentagens médias de cels CD4+ e CD8+ expressando IL-4 em desnutridos foram maiores.pode q funções citotóxicas de cels T CD4+ e CD8+. tem um efeito direto em cels T CD4+.pode ser um fator imunossupressor importante relacionado à resposta imune danificada observada em crianças desnutridas. .

A potencialidade da ativação das céls de cçs desnutridas está q . .Nenhuma diferença foi observada com o grau de desnutrição e o tipo de infecção.Desnutridas/infectadas: q CD69 e de CD25. .Estudos adicionais incluindo o n° pacientes serão necessários para direcionar o relacionamento entre estes fatores.Linfócitos das desnutridas são incapazes de começar seu processo de ativação. e esta descoberta pode ajudar explicar algumas das anormalidades imunoregulatórias da célula T. . .Expressão do antígeno CD69 e CD25: .

. .Conclusão .Estas alterações podem contribuir para a capacidade imunológica reduzida e à sensibilidade aumentada à infecção associada com a desnutrição. .Em contraste. os dados mostram um aumento da produção de IL-4 e IL-10 por células CD4 +e de CD8 + em crianças desnutridas. .A desnutrição danifica severamente a produção de IL-2 e de IFNgama. -Estas descobertas mostram que a desnutrição altera o equilíbrio das respostas tipo 1 e tipo 2.Além disso. a habilidade de ativação das células CD4+ e CD8+ é diminuída consideravelmente.