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Universidade Estadual de São Paulo

Escola de Engenharia de Lorena

Separação e recuperação de
bioprodutos

Prof. Arnaldo Márcio Ramalho Prata


As etapas do processo fermentativo
até o final da fermentação são
denominadas linha ascendente ou
“up stream” e a etapa de recuperação
do produto e tratamentos de resíduos é
chamada linha descendente ou
“down stream”
Esquema geral do processo fermentativo
Preparo do meio Preparo de inóculo
-tratamento da matéria-prima (microrganismo)
- mistura de nutrientes
-ajuste de pH Esterilização Ar
- tratamento térmico

Fermentação Linha ascendente


propriamente dita Processos à montante
“upstream”
(BIORREATOR)

Recuperação do Tratamentos de
produto resíduos
Linha descendente
Processos à jusante
“downstream” Produto
SEPARAÇÃO E RECUPERAÇÃO DE BIOPRODUTOS

• Processos relacionados à etapa


de fermentação
“Upstream” • Microorganismo
• Meio de fermentação
• Fermentação

• Tecnologia utilizada para


“Downstream” recuperação e purificação de
bioprodutos
• Células microbianas
• Células animais
• Células vegetais
Definição: Separação do produto do meio
fermentado, colocando-o na forma mais pura possível
para a aplicação a que se destina.

o A etapa de recuperação de produto começa após


a determinação correta do final da fermentação.

o Esta deve levar em conta o máximo da produção


técnica e a máxima produção econômica.

o O produto de interesse pode estar no interior da


célula ou no meio de fermentação (lembrar que
há situações especiais).
SEPARAÇÃO E RECUPERAÇÃO DE BIOPRODUTOS

Serão abordados os procedimentos envolvidos na


recuperação de bioprodutos do tipo insumos químicos e
biomoléculas e microrganismos, exemplificados a seguir:

Insumos químicos e biomoléculas


Álcoois Polímeros
Ácidos orgânicos Vitaminas
Solventes Aminoácidos
Antibióticos Enzimas
Hormônios Poliésteres
Microrganismos
o Inóculo para processos fermentativos
o Microrganismos fixadores de nitrogênio
o Microrganismos para controle biológico
o Vacinas
o Probióticos

Exemplos de enzimas
Protease de Bacillus Glicose oxidase
Amilase de Bacillus Invertase
Glicoamilase Lisozima
Glicose-isomerase Penicilina acilase
Renina microbiana Lactase
-amilase Lipase
Amilase fúngica Xilanase
É importante observar a escala de aplicação
dos diversos métodos de separação e
purificação de produtos biotecnológicos:

oEscala de laboratório, normalmente para produtos


destinados a estudos acadêmicos e aplicações
específicas

oEscala industrial, quando se busca a obtenção de


grandes quantidades de produto para fins comerciais
SEPARAÇÃO E RECUPERAÇÃO DE BIOPRODUTOS

Tem como objetivo recuperar o produto desejado de forma eficiente,


segura e reproduzível

Está incluída num conjunto de atividades que estão envolvidas no


desenvolvimento de um produto

Avaliação econômica

Atendimento a exigências da legislação

Produção em larga escala

Conjunto de operações unitárias


Purificação
Meio de cultivo com células

de Clarificação
(Separação das células/meio)
bioprodutos
Células Sobrenadante
(produtos intracelulares) (produtos extracelulares)

Remoção de fragmentos de
Rompimento de células
células

Fração sólida Sobrenadante

Separação/Concentração
de moléculas

Purificação

Tratamentos finais
Processamento Upstream

Influência do processo de upstream sobre o


processo de downstream
Estágios de
Adaptação Preparação Processo
Seleção MO pré-
MO de inóculo fermentativo
fermentação

Estabilidade Produção de
Característica Localização do produto metabólitos
dos
microrganismos do produto dentro das secundários
células ou impurezas
Separação e purificação de bioprodutos

Etapa complexa

Características do meio
influenciam

São processos desafiadores


Não existe um
procedimento único
de recuperação de
produto

Cada processo apresenta suas


peculiaridades devido às características
específicas dos diferentes produtos e
dos microrganismos.
Operações envolvidas no processo de purificação de bioprodutos
Filtração convencional Tamanho das partículas

Centrifugação Tamanho e densidade das partículas


Clarificação
Filtração tangencial (Membranas) Tamanho das partículas

Floculação Hidrofobicidade de partículas

Homogeneização Cisalhamento

Ultra-som Cisalhamento
Rompimento
celular
Moagem em moinho de bolas Cisalhamento

Rompimento químico ou enzimático Hidrólise, solubilização ou desidratação


de moléculas que compõem a parede ou
a Membrana Celular
Precipitação Solubilidade

Ultrafiltração (membranas) Massa molar e raio hidrodinâmico de


moléculas
Purificação de Extração em sistemas de duas fases
baixa Solubilidade, massa molecular
líquidas
resolução
Cromatografia de troca-iônica Tipo e densidade da biomolécula

Cromatografia de afinidade Sítios específicos (adsorção)

Purificação de Cromatografia de imunoafinidade Sítios específicos (antigeno/anticorpo)


alta resolução Cromatografia de interação hidrofóbica Hidrofobicidade
Cromatografia de exclusão molecular Massa molar

Membranas adsortivas Massa molar e sítios específicos

Cristalização Solubilidade e Características de


equilíbrio líquido-sólido
Tratamentos
Liofilização Características de equilíbrio sólido-
finais vapor
Características de equilíbrio líquido-
Secagem vapor
Clarificação
Separação das células suspensas de um meio fermentado

Operações unitárias viáveis em escala industrial:


• Filtração convencional
• Filtração tangencial
• Centrifugação

A operação unitária adequada depende da faixa de dimensão da


partícula a ser removida:
Clarificação
Separação das células suspensas no meio fermentado

Filtração

Aplica-se à clarificação de grandes volumes

Realizada em condições não assépticas

Aplicado principalmente para fungos filamentosos: micélio com


densidade muito baixa
Clarificação

Filtração Convencional

Aplica-se à clarificação
de grandes volumes de
suspensões diluídas de
células, produtos
extracelulares e
situações que não
necessitam de assepsia.
Princípio de separação Filtração: tamanho da
partícula
(também forma e compressibilidade do material)

o A suspensão, sob pressão, é perpendicularmente direcionada


a um meio filtrante (filtração convencional).
o Aplica-se a suspensões diluídas de células.
o “A fração volumétrica que atravessa o meio filtrante é
denominada filtrado e o depósito de sólidos (sobretudo células)
sobre o meio filtrante chama-se torta.”

o Alguns tipos de filtro:


1. Rotatório (mais adequado para meios biológicos, pois não é afetado
pela compressibilidade da torta)
2. De pressão
3. Folha (disco) horizontal
Clarificação
Filtração Convencional

Equipamento utilizado:
Filtro Rotativo a Vácuo (FRV)

• O tambor fica parcialmente submerso


em um recipiente que contém a
suspensão.
• Ocorre leve agitação para evitar a
sedimentação.
• Tambor oco e rotativo (1 rpm), • Suspensão é alimentada pela parte
coberto com uma malha metálica externa do tambor.
filtrante, recoberta com terra • A redução de pressão (vácuo), ocorre
diatomácea. no interior do tambor, promovendo a
• Capacidade de 0,1 a 0,2 m3.h filtração (formação da torta).
Clarificação

Filtração Tangencial: Microfiltração

A tensão de cisalhamento do
fluído minimiza o acúmulo de
células e seus fragmentos na
superfície das membranas.

O fluxo de filtrado e o coeficiente


de retenção de solutos ou sólidos
são influenciados pela formação
Fluidos de alimentação escoam de um gradiente de concentração
tangencialmente à superfície de células ou solutos próximos à
filtrante. superfície da membrana e fouling

A formação do gradiente de concentração é reversível com a alteração das


condições de operação do processo, enquanto o fouling necessita de
controle de escoamento e pressão.
Clarificação

Filtração Tangencial: Microfiltração

Membrana de fibra oca

• Possuem elevada área


filtrante por unidade de
filtro.
• Bastante susceptíveis à
entupimentos.

Membrana tipo placa e quadro

• Possuem pequenas áreas


filtrantes por unidade de
volume.
• Podem ser aplicados em
regime turbulento.
• A limpeza é fácil.
Esquema de um Filtro de Pressão
Fatores que influenciam a velocidade de
filtração
- permeabilidade de leito (K)
- área de filtração (A)
- viscosidade do líquido ()
- espessura do leito (L)
- resistência do leito de filtração (L/K)
- compressibilidade da torta (S)
- concentração celular do líquido (X)
- diferença de pressão através do leito (P)
- const. relacionada a tamanho e forma das células (’)
O tempo (t) necessário para a filtração de um volume V de suspensão
contendo células sujeitas à compres-sibilidade, sob uma determinada
pressão e através de uma área A é dado por:

 . ’ . X V2
t=
2 . P(1-S) A2

Obs.: - S varia de 0 a 1,0


- Tortas de células microbianas podem ter S de até 0,8
- Para tortas rígidas, S = 0
Clarificação
Centrifugação

A centrifugação de meios fermentados é uma tecnologia já consolidada. Suas


vantagens sobre o processo de filtração são:

Processo completamente contínuo;

Alta capacidade para pequenos volumes;

Curto tempo de residência;

Equipamento esterilizável por vapor;

Limpeza e operação completamente automatizadas;

Processamento do produto em condições assépticas;

Processamento de microrganismos perigosos em sistema fechado;

Inexistência de custos com auxiliares de filtração, membranas e produtos químicos.


Clarificação

Centrifugação

Princípio de separação: diferença de densidade (também tamanho de


partícula e viscosidade)

Método que acelera o processo de sedimentação por ação de um campo


gravitacional centrifugo

Baseia-se na diferença de densidade entre a célula e o meio líquido, na


viscosidade do meio líquido, na força motriz e a distância radial desde o
centro da centrifuga até a célula e no diâmetro da particula.
Alguns tipos de centrífuga

a) Tubular; b) Câmara; c) Disco; d) Rolo


Clarificação

Centrifuga tubular

• Podem operar sob refrigeração


(13.000 a 17.000 x g)
• Capacidade limitada de volume

Aplica-se em suspensões de no
máximo 30 g/L de células
Centrífuga
tubular de alta
velocidade
Clarificação
Centrifuga de disco

Aplica-se em suspensões de no
máximo 250 g/L de células

• Atuam em valores menores de


centrifugação (5.000 a 15.000 x g)
• Permite processamento continuo
de 200 m3/h
• Discos aumentam a área de
sedimentação e reduzem o tempo
necessário para centrifugação

https://www.youtube.com/watch?v=dxTT_bP6IwI
Centrífuga de rolo (decanter)

https://www.youtube.com/watch?v=FhS5vN4r5LA

https://www.youtube.com/watch?v=w1E452YD1zw

https://www.youtube.com/watch?v=jGwBpGELngk
Fatores de aceleração das centrífugas mais comuns

Ultracentrífugas 105 – 106 x g


Centrífugas tubulares 13000 – 17000 x g
Centrífugas de câmara 6000 - 11000 x g
Centrífugas de disco 5000 - 15000 x g
Centrífugas de rolo 1500 – 4500 x g

Critério para ampliação: Fator de aceleração . tempo ==> . t

Se uma separação satisfatória é atingida com 3000xg


durante 5 minutos, o mesmo resultado pode ser
alcançado com 1500xg e 10 minutos, em escala industrial.
Obs.: Ultracentrífugas operam descontinuamente e
normalmente têm baixa capacidade de processamento

O fluxo volumétrico de alimentação para uma


centrífuga pode ser determinado pela expressão:

Q = d2 . . g. . A
18 
Onde:
Q é o fluxo volumétrico de alimentação
 é a diferença de densidade (dens. Sólido – dens. do líquido)
g é a aceleração da gravidade
d é o diâmetro da partícula
 é o fator de aceleração
A é o equivalente de área do rotor
 é a viscosidade dinâmica do líquido
Cálculo de “g”:

N2 . R
g=
89500

Onde:
N é a velocidade ou frequência de rotação do eixo (rpm)
R é o raio da circunferência (cm)

Raio: distância entre o centro do eixo e o fundo do tubo ou


da câmara de sedimentação
Exemplo de aplicação para centrífuga
Uma determinada indústria apresenta uma produção de meio
fermentado igual a 180 m3/dia. (a) Considerando as características do
meio e da centrífuga a ser empregada, quantas unidades deste
equipamento você solicitaria ao departamento de compras da empresa,
de modo a garantir a separação das células do meio de fermentação,
sem risco de parar a produção? (b) Considere, agora, que foi estabe-
lecido que serão compradas 8 centrífugas com equivalente de área igual
a 0,10 m2. Qual deve ser o fator de aceleração destas centrífugas?

Dados: Densidade do sólido = 1000 kg/m3


Densidade do líquido = 900 kg/m3
Viscosidade do líquido = 10-2 kg/m.s
Diâmetro da partícula = 0,01 mm
Fator de aceleração = 8000
Equivalente de área = 0,10 m2

Q = d2 .  . g .  . A
18 . 