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MICROSCOPIA

 Técnica de observación y estudio,
de objetos no visibles a simple vista.

 Robert Hooke.1660-1665.
 Microscopio compuesto
 Hongos filamentosos.

 Antonie van Leeuwenhoek. 1684
 Microscopio simple
 Bacterias
 y protozoarios.

Microscopio
 Tipos microscopios:
 Simple: Una lente: Lupa.

 Óptico/Compuesto: Tiene dos o más sistemas de lentes (ocular y
objetivo): luz visible.
- Trabajo de rutina Microb: Forma , agrup, esporas?

 Electrónico: Sistema de imanes para guiar el flujo de electrones,
hacia el objetivo.
 Estructuras intracelulares.
 M. Efecto Túnel; MFA. Ubicuidad del e; Efecto cuántico;
Potencial, corriente túnel
 Estructuras atómicas

 El microscopio óptico, compuesto:
 Tipos de microscopios ópticos/Luz:
Campo claro.
Campo oscuro.
Contraste de fases.

Fluorescencia, Luz UV
Confocal, Laser

m. ambiente.  abs-dispersan luz. campo claro: Dos series de lentes : Objetivo y ocular. componentes.  Luz visible  Producción imagen :  Células . dif grados:  Diferencias contraste: Imagen  Tinciones (Microorganismos pigmentados). .  El microscopio Óptico.

Macrométrico T. Micrométrico Diafragma iris Lámpara Platina T. del carro Base .Componentes básicos de un microscopio Microscopio de campo claro Oculares Brazo Revólver Objetivos Condensador T.

Fundamentos de óptica: Aumento y Resolución: .

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◦ Ojo humano: 0.0 micras 200.Fundamentos de óptica: Aumento y Resolución:  CAPACIDAD DE AUMENTO/SIN LÍMITE (1000-1500X). limitada 400-700 nm.2 mm = 200.  Poder resolución del ojo humano.2 micras= 200 nm. propiedades físicas lente (0j0)y luz (Visible). ◦ Límite de lo que se puede ver.2 nm (1000X) ◦ .0002 micras 0.000 nm ◦ M óptico 0.  RESOLUCIÓN: Limitada. (1000X) ◦ M electrónico 0.

•Límite de resolución (d): LR = l/ 2AN ( =0.6/0.2 micras .8/0.4/0. Poder de resolución de una lente .2 micras ) • Distancia mínima entre dos puntos/ entidades separadas • Dos objetos separados 0. PODER DE RESOLUCIÓN- •Poder de Resolución: Capacidad lente distinguir dos puntos próximos/ separados. resolución + Lente A B C D •Valor más importante.

RESOLUCIÓN: Limitada. -PR=Inversamente proporcional. Filtro de luz azul . propiedades físicas lente y luz. Límite de Resolución (PR) depende dos factores: •Longitud de onda: LR =  / 2 N •400-700 nm.

AA .Poder de Resolución depende dos factores: LR =  / 2 N APERTURA NÚMERICA=AN •Directamente proporcional •Apertura Numérica depende de: •AN = n (sen θ/2) •Depende Apertura angular •Índice refracción •n=IR •sen θ= Apertura Angular.

no entran objetivo: ángulo divergencia mayor AA (u) . salen de la preparación. musetra.La apertura angular. muy pequeños. -Apertura angular AA: -AA= ½ del Angulo. entre los rayos de luz más divergentes. Lente objetivo. objeto. -Lentes objetivo: -Plano convexos. -Apertura angular/visual= muy angosta. •AN = n (sen θ/2) Rayos de luz. y entran al objetivo -Capacidad de las lentes objetivo captación/ admitir luz.

•AN = n (sen θ/2) LR =  / 2 N η aire = 1. perdidos refracción y reflexión.5 (Rayos. ángulo más grande AA. se pierden)  aceite = 1. dentro AA ) .0 ( Rayos.

 Captando más rayos divergentes. 100X 40X .  Incrementa.8 mm a 0.La Apertura Numérica (NA):  Uso AI:  LENTE-OBJETIVO llevada más cerca del objeto:  Distancia de trabajo. disminuye de 1. Poder de Resolución.2 mm.

65 N.Límite de Resolución:  530 nm  Ejemplo: 100x 1.4 m 2 NA 2 X 0.53 = 0.65 .A.3 N.A. objetivo a 530 nm= 0.53 = = 0.53 um  0.3 40 x 0. objetivo a 530 nm  = 0.20 m 2 NA 2 X 1.

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vivos sin teñir . • Uso de aceite de inmersión . campo obscuro • Gran Poder resolución: • Mayor . campo claro o contraste fases • Visualizar preparaciones húmedas. de Mo. Tipos de microscopios ópticos/Luz: Microscopio de campo obscuro: • Objetos iluminados. Movilidad de mo: Obs flagelos.

refracta luz hacia objetivo. • Presencia de muestra. Solo periféricos  Sustituir condesador Abbé X Condensador de campo oscuro  (Cardioide y Paraboloide) • Luz sobre preparación. . previene la entrada de los rayos de luz centrales en el objetivo. • Mo brillantes/campo oscuro. solo en forma oblicua: campo vacío. oscuro.óptico: Sistema iluminación modificado:  Condensador especial. Microscopio de campo oscuro: • M.

. Movilidad de mo: Obs flagelos. Campo obscuro Campo claro Microscopio de campo obscuro Gran Poder resolución: Mayor campo claro o contraste fases Mo. vivos sin teñir .

/No tinción. • Tinciones. estructuras internas. 1953 . Muerte/distorsión • Fritz Zernike: Premio nobel Física . • células vivas. Microscopio de contraste de fases: • Imagen oscura/fondo brillante • Preparaciones en fresco.

• Imagen oscura/fondo brillante . Placa cambiadora de fase. antes condensador -Disco transparente. Objetivo=Retarda o avanza ¼ L. Retardados: Amplificado: -Diafragma especial anular. célula. Microscopio de contraste de fases: • Aumentar las diferencias de contraste • ENTRE CELULAS-M. AMBIENTE: • Rayos de luz.

(Oscuro). Refractada Perceptible al ojo humano Cambio de fase. pasa través del objeto. pasan otra parte del anillo transparente: no avanzado. Directa Refractado. ni retardado. se enfocan anillo. retardado o avanzado ¼ long onda respecto a primero.(Brillante) Los rayos interfiere . Directa Refractada •Imagen oscura/fondo brillante .  Convierte “diferencias de fase” en “diferencias de intensidad”  Luz incidente sobre muestra: dos rayos Directo. Pasa alrededor del objeto. Los rayos se amplifican. Los rayos que .

Cambio de fase. •Imagen oscura/fondo brillante Microscopio de contraste de fases . Los rayos se amplifican. (Oscuro).(Brillante) Los rayos interfiere .

Microscopio de contraste de fases Campo claro Campo obscuro Contraste de fases •Estructuras internas células vivas .

a los rayos incidentes  Luz incide es de menor λ. mayor. Visualizar muestras. Fluorescencia:  Capacidad de un objeto de emitir rayos de una longitud de onda diferente. emiten fluorescencia. Microscopio de fluorescencia .

invisibles. emiten fluorescencia.  Auramina.  Capacidad de Fluorecer :  Auto florescencia (clorofilas)  Colorantes fluorescentes: fluorocromos  Sulfato de quinina. fluórese a violeta 400 nm. -Objetos invisibles Luz UV (150-350 nm).  Auramina LR = / 2 N Microscopio de fluorescencia  La muestra se tiñe con una sustancia fluorescente: se ilumina con luz de ondas cortas (UV). .Visibles con:  Sulfato de quinina. Visualizar muestras. fluórese a 600 nm. amarillo ./emite luz longitudes ondas más largas (verde).

 Visualizar muestras. Técnica. ◦ Inmuno-fluorescencia: Sustancia fluorescente se une a anticuerpo específico. emiten fluorescencia. área clínica Microscopio de fluorescencia .  Microbiología Diagnóstica: ◦ Bacilo de tuberculosis. contra ciertos mo.

Tubo micro: Protección de ojos. ◦ Lámparas/filtros (selección ) ◦ Condensador ◦ Uso de fluoro-cromos Condensador Fluorescencia Contraste de fases Lámpara (uv) Microscopio de fluorescencia . Dispositivos especiales: ◦ Luz UV ◦ Filtro opaco al UV.

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 Espécimen iluminado con luz de cierto color.  Se retratan distintos planos. de barrido láser.Microscopio Confocal.  contraste impresionante/  fondo oscuro. . éste emitirá luz brillante otros colores. luz de un láser.  Potente y monocromática  Excita en muestra fluorescencia.  Imagen tridimensional Rotada: ◦ Estudiar la muestra desde un ángulo distinto/ cual se retrató.  Fuente de iluminación. se integran: Tridimensional.

Microscopio confocal de barrido láser .

Microscopio confocal de barrido láser .

.  1938. campos magnéticos vacio. Luz visible 400-700. Función Lentes.5 nm.  Lentes opacos e. comercial.  1940. Hillier y Vance RCA. USA.-Radiaciones electromagnéticas LR =  / 2 N long onda e. M electronico: LR= 0. desviados y enfocados.2 micras= 200 nm. primer micro e .2 nm ( 1000 veces M op). 0.Microscopio electrónico de transmisión TEM: Transmision Electron microscope 1930. Berlin.0 nm M óptico 0.  e .0002 micras 0. Von Borries y Ruska.

250.000 X Pantalla fluorscente: Imagen. 4-6 veces. 2000X transmitidos Muestra Eq Ocular: Imagen real . 2000x Fuente iluminación: electrones transmitidos (filamento tungsteno) Cátodo Condensador: Enfoca. Electrones dispersados 1-2x 10( 6)X: Monitor TV ordinario Pantalla Microscopio electrónico Transmisión . Condensador: Imagen real .e transmitidos muestra Muestra Eq Objetivo: e- Imagen real .

Microscopio Electrónico de Transmisión .

( metacrylato. bajo poder de penetración: .Microscopio electrónico de transmisión TEM: Transmision Electron microscope  Muestras:  Contraste adecuado:  Material biológico ( C. H. N)= transparentes a. uranio. e) ◦ Grado desvió electrones: diferencias contraste.Célula aislada-gruesa .  ácido ósmico. lantano o plomo  ( alto PM):  Haz electrones. ultra-microtomo- diamante) .Cortes ultrafinos: 0. O.02 u. permanganato.

Microscopio electrónico de transmisión TEM: Transmision Electron microscope  Poder resolución:  Estructuras sub-celulares: ac nucleicos. .

Microscopio electrónico de transmisión TEM: Transmision Electron microscope .

imagen. Microscopio electrónico de barrido. SEM comercial.  Fuente de e.  pistola de tungsteno caliente. ◦ Cámaras. ◦ 1960. SEM: Scanning Electrón Microscope. dispersados pantalla.  hexaboruro de lantano  Haz e. barre superficie muestra. .000 X.  E desviados. ◦ . ◦ Tercera Dimensión: Solo Superficie ◦ Aumentos: 100. Microfotografías electrónicas.

Microscopio electrónico de Barrido .

 Imágenes gran profundidad: efecto tri- dimensional ◦ TEM.= 10 nm .Microscopio electrónico de barrido  Preparación muestras sencilla: ◦ . recubre fina capa. especímenes muy delgados Esporas dmáx. vapores metal pesado: oro (Sombreado). Muestra. profundidad muy limitada.

G. Campylobacter jejuni Bacillus S aureus Diferencias: aspecto y textura. .y G+.

Tercera Dimensión .000 X. 100. superficial celula.Microscopía electrónica 1-2x 10( 6)X: Aumentos: Estructuras sub-celulares: . Extraordinaria Profundidad: Topografía. ac nucleícos.

Microscopio efecto túnel .

◦ Ubicuidad. Mapas muy precisos de superficies Atómica de metales o de materiales semiconductores. escapando de las fuerzas electromagnéticas provocando un túnel . permite E. escapa del átomo. . BASADO:  UBICUIDAD e: Nube de posiciones. Microscopio Efecto Túnel  imágenes. mecánica cuántica: diferencia de potencial eléctrico.  Efecto túnel.

 Una sonda (extrem fino.  “túnel cuántico:  "corriente túnel". pueden.  “diferencia de potencial eléctrico”. Microscopio Efecto Túnel  El microscopio aprovecha habilidades escapatorias de e. abandonar los átomos de origen. . Creando. e punta) se acerca a una distancia muy corta (diez millonésima mm) superficie metal a observar:  Los e superficie del metal.

“túnel cuántico: "corriente túnel". Microscopio de Efecto Tunel . “diferencia de potencial eléctrico”.

del metal:   La resolución del microscopio.  A medida que la sonda barre la superficie. espectacular:  PR (LR)=menos de un décimo del radio promedio de un átomo:  . la intensidad de la "corriente túnel" va informando sobre el relieve y la topografía estructura atómica.Microscopio Efecto Túnel  La intensidad de "corriente túnel" depende de distancia sonda-superficie.

. en los que cada átomo puede distinguirse de su vecino También imágenes atómicas de moléculas de ADN.Mapas muy precisos de superficies de metales o de semiconductores.

conductores o Semiconductores. sonda o punta afilada.  .  Registra topografía.: Muestras biológicas  (1x10 − 9m = 1nm). El Microscopio de fuerza atómica (AFM: Atomic Force Microscope). piramidal o cónica.  Laser  No requerido.

Utilidad:.  formas farmacéuticas y otros materiales orgánicos e inorgánicos .  ESM IPN. Investigaciones neuroquímicas: Estudios de Neurotransmisores (SNC) Mal de Parkinson y Alzheimer. Análisis de: muestras biológicas.