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 Aproximadamente 2 millones de
personas están expuestas a la
malaria con un estimado de 250
millones de casos clínicos y
alrededor de 800.000 muertes al
año
 Cuatro especies de Plasmodium
se sabe que causan la malaria
en humanos: P. falciparum, P.
vivax, P. malariae y P. ovale.
  Las presentaciones clínicas
 Œuchas regiones endémicas
con malaria tienen informe de
infecciones mixtas de estas
especies y la prevalencia de
infecciones mixtas varía según
la región geográfica.
de la malaria son a
menudo inespecíficas y, en
consecuencia muchas
enfermedades febriles de
etiología desconocida se
atribuyen a la malaria (que
resulta en el diagnóstico
presuntivo y tratamiento)
 Los instrumentos existentes
para el diagnóstico de la
malaria incluyen microscopía,
pruebas de diagnóstico
rápido (PDR) y herramientas
moleculares
 Sin embargo, existen varios
 Desde hace más de un siglo,
la microscopía se ha
mantenido como el estándar
para la detección de la
malaria y la determinación
de especies en áreas
endémicas.
desafíos en el desempeño del
diagnóstico microscópico
para el uso clínico de rutina.
 Las PDR son pruebas
inmunocromatográficas
diseñadas para detectar
parásitos en los productos
de la sangre humana.

 Las PDR se utilizan cada

vez para el diagnóstico de
la malaria debido a que
son rápidos y fáciles de
usar sobre todo en
entornos de recursos
limitados.
 Debido a que las PDR son
sólo pruebas cualitativas, la
densidad de la parasitemia
no puede determinarse con
precisión.
 Los métodos moleculares
han demostrado ser útiles en
la identificación de especies y
la detección precisa de las
infecciones de especies
mixtas, además de la
detección de infecciones
subclínicas.
 Sin embargo, el uso de
herramientas moleculares se ve
obstaculizada por algunos factores,
incluido el costo elevado de la
colocación del equipamiento inicial
y la imposibilidad de obtener
reactivos debido a una
infraestructura en entornos de
muchos campos.
 La prueba más utilizada para el
diagnóstico molecular de la malaria
es la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR)-basada en la
amplificación del ADN ribosomal
18S (ADNr) y del gen que permite
la detección de las diferentes
especies de parásitos de la malaria
humana, basados en productos de
diferentes tamaños de PCR.
  Sin embargo, este método
requiere mucho tiempo, costoso y
es laborioso, ya que requiere de
cinco reacciones de PCR por
separado para detectar P.
 cl método de PCR anidada falciparum, P. vivax, P. ovale y P.
desarrollada por Snounou ha malariae.
sido ampliamente utilizado
en estudios de laboratorio y
en el diagnóstico clínico,
incluso en una referencia de
diagnóstico de laboratorio en
los cstados Unidos.
 cl PCR multiplex semi- anidada
utiliza una imprimación
universal 18S ADNr marcha
atrás y dos hacia adelante
cebadoras 18S rDNA, uno
específico para el género
Plasmodium y otro específico a
todos los ADNr 18S de los
mamíferos.
 cl múltiplex de una sola
ronda utiliza un género
Plasmodium primer
específico inversa con cuatro
especies con interés en  Padley afirma la sensibilidad
cebadores específicos. de que el ensayo sea de:
 0,02 p / Ɋl para P. falciparum
 P. ovale 0,004 p / Ɋl

 Y no prueba de sensibilidad
de la prueba para P. vivax y
P. malariae.
 Además de los tradicionales
herramientas moleculares
basados en PCR y PCR en
tiempo real han demostrado
 Sin embargo, varios factores
recientemente ser una
impiden el uso de este
alternativa sólida para el
método en las regiones
diagnóstico de la malaria.
endémicas de malaria,
incluido el costo, la falta de
infraestructura y falta de
apoyo técnico debido a
problemas de
infraestructura.
 Los tres métodos descritos
anteriormente basadas en la PCR  Ύtodos:
son buenas alternativas a la
microscopía y PDR.  Anidada
 Sin embargo, nadie ha evaluado
que estos métodos de PCR  Semi-anidada
tradicional es mejor en la detección
de infecciones mixtas por  Un sólo tubo múltiple
Plasmodium.
 Por lo que se han comparado en
este artículo los dos métodos con
el método multiplex anidada
utilizando cantidades conocidas
del laboratorio de ADN derivados
Plasmodium solo y mixtos cócteles
que contienen las cuatro especies
de ADN.
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 ADN extraído de :
 Cultivos P. Falciparum
(3D7)
 Derivados de monos P.
vivax (SV4)
 P. malariae (Uganda)
 P. ovale (Nigeria)
 Para las cuatro especies:  cl # total de glóbulos rojos
por micro litro se determino
 Frotis delgados
para cada especie usando un
 Tinciones DzCoulter counterdz
 Conteo

 Para conteo de glóbulos infectados

 ADN aislado:
 Un total de 8x106 parásitos por
especia
 Suspendido en 200µl estéril de
Tc
 Se tomaron alícuotas y se
guardo a -20°c
 Diluciones hasta: 0.04
genomas/µ
 cvaluación de limites de
diagnóstico:
 Detecciones individuales
 Detección de múltiples
especies

 7 repeticiones
 Cocteles mixtos: 2µl de cada especie
en dif. concentraciones
 Cocteles mixtos:
 Bajos niveles de infección
 Variaciones en niveles
 Predominancia de
parásitos
 Cantidad similar de
parásitos es rara.
  



 


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1. Nested PCR
2. Semi-nested multiplex
3. One tube multiplex
   &



 cspecies de Plasmodium A 0.4 p/µl

 ½ 
'&


  

 y P. Vivax (o.4
p/µl)
 X P. Œalariae (0.4 p/µl)
 P. Ovale (A 4 p/µl)

 Diferencia de
sensibilidad
 ¾ especies
 Œ

 Œenos especificidad
 Al menos detecta 2
especies
simultáneamente
 Detecta correctamente
P. falciparum en una
mezcla, pero no a
P. malariae y P. Vivax.
 Confiabilidad: Œenos de 50% de las pruebas
realizadas.
 Identificación de P. Ovale si la
concentración del DNA era
igual o mayor que 10 p/ul.
 





(
 1 p/µl. De P. Ovale en mezclas usando: el semi-
nested PCR, y el multiplex PCR.

 1ro: 22/42
 2do: 7/42
 A de las concentraciones esperadas para P. Vivax
9/42

 Valoración : 7 replicaciones
º


  
 Reactivos + plásticos
consumidos (muestra)

 Nested PCR $8 dll/m

 Semi-nested PCR $5
dll/m
 Œultiplex PCR $4 dll/m
 &º )&c

 Se demostró que cl Dz‰
     dz es la

mejor prueba basada en PCR para la detección de
diversas especies causantes de la malaria.

 Promoviendo la optimización de nuevas técnicas

moleculares puede incrementar el éxito en las
pruebas de PCR tradicionales.
 cl semi-nested arrojó mejores resultados si se trataba
con muestras con una misma especie. No con mezclas.

 Las técnicas moleculares como las estudiadas, son las

más precisas, para cualquier nivel de infección.
 


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+