Oleh :

Nama : Muhammad Erfan Syaifullah

NIM : 105040201111028
Kelompok : Rabu, 06.00
Asisten : Tomy Marmadion
 Isolasi DNA merupakan langkah
mempelajari DNA. Salah satu prinsip
isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi.
Sentrifugasi merupakan teknik untuk
memisahkan campuran berdasarkan berat
molekul komponennya.
 Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan
berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan
akan berada pada bagian atas tabung.
 Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi
yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan
pelet pada bagian bawah.
Tahapan umum isolasi DNA :
1. Perusakan dinding sel, yang dilakukan dengan
penambahan nitrogen cair
2. Lisis membran sel, yang dilakukan dengan
penambahan detergen kationik
3. Pemurnian, merupakan proses menghilangkan dari
berbagai kontaminan, seperti fenol, polisakarida, RNA,
protein
4. Presipitasi, merupakan proses penggumpalan DNA
menggunakan isopropanol dingin
Isolasi DNA dengan teknik sentrifugasi akan
mengendapkan DNA. Supaya hasil isolasi
berupa DNA murni yang tidak tercampur
dengan molekul-molekul lain maka dalam
proses isolasinya dicampurkan berbagai
macam larutan,yaitu :
 N2 cair berfungsi dalam perusakan dinding sel sehingga
membantu proses penggerusan.
 CTAB(Cetyl Trimetyl Amonium Bromide) berfungsi melisis
membran sel.
 CHISAM(Chloroform Isoamil Alkohol) berfungsi mengurangi
kontaminasi protein dan polisakarida.
 Isopropanol dingin berfungsi membantu proses
penggumpalan DNA.
 Buffer berfungsi sebagai penyeteril .
 TE(Tris EDTA) berfungsi untuk meresistensi.
1. Mortar & pestle 7. Mesin elektrofotometer
2. Tabung nitrogen 8. Mesin spektrofotometer
3. Tube appendorf 1,5 9. Mesin sentrifuse
ml/2 ml 10. Pipet tip
4. Mikropipet
5. Oven
6. Freezer
Mortar & pestle Tube appendorf

Mikropipet

Mesin spektrofotometer

Tabung nitrogen
Freezer Pipet tip

Mesin sentrifuse
Oven
 LANGKAH KERJA

Timbang daun sebanyak 0,5 gram

Masukkan ke dalam mortar,yang mana sebelumnya sudah

diberi alkohol supaya steril
Ditambah N2 cair,tujuannya membantu proses penggerusan.

Digerus sampai halus,karena mempengaruhi banyak atau

tidaknya DNA yang akan diisolasi.
 Masukkan dalam TUB

Ditambah CTAB (Cetyl Trimetyl Amonium Bromide)

sebanyak 700 mikro liter,tujuannya sebagai detegen
kationik dan melisis membran sel agar isi sel
(berupa:nucleus,mitokondria,plastida) keluar
 Diaduk (di homogenkan)

Inkubasi 65̊C,selama 30 menit,tujuannya membantu kerja

CTAB dalam melisis

Setiap 15 menit sample dikocok,agar rata dan mengendap

 Setelah di inkubasi ,sample di diamkan

Ditambah CHISAM (Chloroform Isoamil

Alkohol)/CIA,tujuannya mengurangi kontaminasi protein
dan polisakarida
Dihomogenkan menggunakan vortex, agar tercampur dengan
CIA

Sentrifuse dengan kecepatan 6000 rpm, selama 10 menit,

tujuannya untuk memisahkan antara supernatan, fase
organik dan fenol
 Didapatkan 3 lapisan dalam TUB

Supernatan dibuang

Ditambah CIA,tujuannya mengurangi kontaminasi protein

dan polisakarida
Sentrifuse dengan kecepatan 6000 rpm,selama 10 menit

Supernatan dibuang
Ditambah isopropanol dingin,tujuannya membantu dalam
proses penggumpalan.

Di bolak-balik sampai terlihat benang-benang putih, yang

mana merupakan DNA.
 Inkubasi di freezer selama 30 menit

Sentrifuge dengan kecepatan 6000 rpm,selama 10 menit

Buang isopropanol dingin,sehingga tersisa DNA palet

 Ditambah buffer,fungsinya sebagai pencuci

Buffer dibuang,kemudian dikering anginkan

Ditambah TE (TRIS EDTA),tujuannya untuk meresistensi

 Larutan DNA

Di uji isolasi DNA nya

 Sentrifuse 1

 Lapisan 1:
Supernatan merupakan cairan yang telah terkurangi unsure
padatannya dari larutan CATB+DNA
 Lapisan 2 :
Organik merupakan sisa-sisa organel yang berupa tumpukan dan juga
mengendap.
 Lapisan 3 :
Fenol Bisa dilihat secara fisual,tanda-tanda kontaminasi: coklat. Apabila
terkontaminasi tidak perlu mengulang dari awal hanya ditambahkan
dengan larutan buffer CIA.
 Sentrifuse 2

 Lapisan 1
(berwarna kuning):DNA ,yang mana DNA yang digunakan
dalam proses isolasi DNA harus murni:Protein, Fenol,
Polisakarida.
 Lapisan 2
(berwarna putih): CIA(Chloroform Isoamil Alkohol),
fungsinya untuk mengurangi kontaminasi protein dan
polisakarida
 Sentrifuse 3

Didapatkan DNA pelet yang menempel pada bagian

bawah.Untuk mendapatkan larutan DNA supernatant
dibuang terlebih dahulu kemudian DNA pelet dicuci 1 kali
dengan buffer dan ditambah larutan TE yang tujuannya
untuk meresistensi.Setelah didapatkan larutan DNA
kemudian diuji isolasi DNA nya.
1. ELEKTROFORESIS dengan gel agarose
Tipe kontaminan :
 Smear : kontaminan protein / DNA terdegradasi
 Berapi-api : kontaminan polisakarida
 Pita tebal di bagian bawah gel : kontaminan RNA
2. SPEKTROFOTOMETER
Prinsip kerjanya menggunakan serapan panjang
gelombang.
lamda 260 : diserap DNA
lamda 280 : diserap protein
1,8 – 2,0 : DNA murni (tidak terkontaminasi)
< 1,8 : kontaminasi protein
>2,0 : kontaminasi fenol, kloroform atau
kemungkinan terkontaminasi RNA
THE END