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Métodos para el estudio de

aislamiento de células
Estudio de los componentes
celulares
• Implica:
• 1. RUPTURA DEL TEJIDO
• 2. FRACCIONAMIENTO CELULAR
• El fraccionamiento celular es un conjunto de
métodos y técnicas que tiene como objetivo
obtener fracciones puras o enriquecidas de un
determinado componente celular.
ETAPAS
• Todo fraccionamiento tiene dos etapas:
• Ruptura de las células o tejidos para obtener
un lisado celular o tisular en el que la fracción
deseada se encuentre en condiciones
adecuadas para su purificación.
• Separación de fracción deseada del resto de
componentes celulares mediante algún
criterio como puede ser una diferencia de
densidad (centrifugación en gradiente o
diferencial) , presencia de algún antígeno, etc.
Ruptura de células y tejidos
• 1) Homogenización:
• Esferas: choque de vidrio con las células.
• Tamaño de las esferas:
• 0.1mm – bacterias y esporas
• 0.5mm- levaduras, micelios, microalgas,
células animales, celulas tripsinizadas.
• 1.0-2-3 mm cerebro, músculo, piel, hojas etc
• Se utilizan esferas en un 50% del volumen de
biomasa .
Ruptura mecánica. Esferas vidrio
Licuado
• Homogenización por uso de cuchillas. Se
obtiene mejor resultado cuando se usan
detergentes o solventes. Cuchillas rotan a
6000-5000rpm en un contenedor
• Se pueden reducir las partículas a 4 micrones
(buenas para citometría de flujo)
• No se utilice con microorganismos
• Puede haber degradación enzimática
Homogenización con Politrón
Produce poca turbulencia. Protección
de organelos
Menor velocidad y tiempo de
exposición. Genera menos calor

El vástago contiene cuchillas internas


que giran a gran velocidad.

Se produce gran cantidad de espuma

Debe de hacerse en baño de hielo

Pueden utilizarse solventes orgánicos


y/o detergentes
Choque osmótico
• Las células se hacen estallar al someterlas a un
medio hipotónico lo cual hace que la
membrana no resista la presión osmótica.
• Puede ocasionar el daño a las membranas de
algunos organelos
• Se utiliza para obtener mitocondrias y
cromosomas.
Mortero y mano
• Método convencional de rompimiento por
fricción. Pueden emplearse materiales
abrasivos como cuarzo, vidrio molido, arena o
materiales silíceos.
• La masa celular se mezcla en una relación 0.5-
1.0
• Se genera calor por la fricción
• Aplicar mejor en muestras
• congeladas.
Ruptura con émbolo y
tubo (Potter Elvehem)
Los tejidos deben ser
previamente picados y se
suspenden en un volumen de 4-
10 veces
Es mas útil en preparción de
organelos subcelulares de
tejidos frágiles como cerebro e
hígado. Permite un mejor
control de la temperatura
generada por la fricción
No sirve para microorganismos
Sonicación
• Consiste en la aplicación de ultrasonido a una
suspensión celular.
• Dependiendo de la frecuencia, intensidad y energía
aplicada se pueden destruír las estructuras
subcelulares o solubilizar complejos protéicos. Las
vibraciones de alta intensidad generan ondas de
ultrasonido que se expanden y colapsan contra las
células. A esto se le llama CAVITACIÓN
• Esta se puede aumentar adicionando esferas de
vidrio.
• Hay que evitar el sobrecalentamiento.
Ultrasonificación
• Generación de intensas ondas sónicas en un
medio líquido.
• Se utiliza un sonicador que opera de dos
formas:
• Por pulsos: vibraciones de 0.1-0,9 pulsos por
segundo. Se produce poco calor
• Contínuo: puede utilizarse continuamente por
tiempos hasta de 15 min. Levaduras requieren
de 3-10 min . E coli con 40 s
• Presenta desarrollo de calor y oxidación.
Ultrasonicadores

Inconvenientes
Generación de calor
Daño por radicales libres
Se puede usar DTT o sH
Lesión en membrana celular

Usos: para transferencia de


DNA
Plasmídico en protoplastos y
células intactas
Compresión -Descompresión
• Se emplea la aprensa francesa que consiste
del paso de las células a gran presión por un
pequeño orificio a una cámara de baja presión
• >Se obtiene fragmentos de 0.3-0.5mm
French press

COMPRESIÓN
Congelamiento-descongelamiento
• Requiere períodos prolongados de tiempo
(hasta 36 h) para el congelamiento-
descongelamioento
• Para tejidos animales y vegetales y masas
microbianas.
• Se utiliza nitrógeno líquido
congelamiento
Requerimientos para la ruptura
• Seleccionar un regulador adecuado: Fosfatos,
Hepes, Mes, Tris etc.
• Realizar la ruptura a pH 7.
• Utilizar inhibidores de Proteasas.
• Mantener una fuerza iónica fisiológica(NaCl
0.15M).
• Utilizar Cofactores.
• Realizar toda la operación en frío.
Después de la ruptura, viene la
centrifugación
• Para separar partículas biológicas en una
suspensión, se utiliza la fuerza gravitacional
empleando la centrifugación.
• Manejando las variables de fuerza centrífuga y
tiempo podemos separar los organelos
dependiendo de su tamaño.
• En centrifugaciones sucesivas se obtienen las
fracciones de interés.
PROCEDIMIENTOS DE
CENTRIFUGACIÓN.
• Hay dos tipos:
• Preparativa: para el aislamiento de partículas
específicas
• Analítica: Medida de las propiedades físicas de
una partícula al sedimentar.
Tipos de centrifugación
• Centrifugación diferencial. Se basa en la diferencia de
densidad de las moléculas.
• Centrifugación isopícnica. Para separar partículas con la
misma densidad. Se utilizan gradientes de densidad como
CsCl (p ej DNA)
• Centrifugación zonal: Separación por diferencia de masa.
Sedimentan a diferente velocidad. Se utilizan gradientes
preformados (sacarosa, glicerol). Cuidar el tiempo de
centrifugación, de lo contrario se van al fondo.
• Ultracentrifugación.. Para estudiar las características de
sedimentación de partículas
Centrifugación diferencial
• La muestra es centrifugada a una velocidad
dada. Se obtiene un sobrenadante y una
fracción sedimentada (pellet).
• La muestra es aislada de acuerdo a su
velocidad de sedimentación, a una fuerza
centrífuga constante, y es proporcional al
tamaño de la partícula.
• Desventaja: El pellet es una mezcla de todos los
componentes sedimentados.
• Rotor utilizado: de ángulo fijo o de columpio.
Centrifugación diferencial

Núcleos y fragmentos de células sedimentan primero


Seguidas de mitocondrias y finalmente microsomas (RE YmP)
Centrifugación por gradiente de
densidad (centrifugación zonal).
• Separa las partículas que tienen igual o
diferente densidad de flotación pero difieren
en forma y tamaño.
• La muestra se monta en la superficie del
gradiente de sacarosa u otro medio viscos
• Rotor utilizado de columpio
• Ejemplo : para aislar subunidades ribosomales
Separación de Organelos
• Los organelos pueden separarse en base a su
densida
• Densidades de algunos organelos:
• Reticulo endoplsamico rugoso: 1.20 g/cm3
Vesículas de Golgi : 1.14
Membrana plasmática : 1.12
Los gradientes de densidad ayudan
a la separación de organelos
• La estrategia general es:
• 1. centrifugación diferencial
• 2. centrifugación zonal
Este gradiente puede ser:
• Contínuo : 0-300mM sacarosa
• Discontínuo con 2 o 3 fases.
• O Centrifugación isopícnica (para DNA)
Centrifugación isopícnica
• También es una centrifugación al equilibrio.
• La muestra se mezcla con el ClCs y la
suspensión homogénea se centrifuga y el
gradiente se establece durante la
centrifugación.
• Se utiliza un rotor de columpio o de ángulo fijo
• Sirve para aislamiento de plásmidos
Centrifugación en gradientes al
equilibrio
• Es una variante de la anterior
• Se centrifuga el cloruro de cesio hasta alcanzar
el equilibrio (que se forme el gradiente)
• Se monta la muestra cuando ya este formado
el gradiente.
• Se utiliza rotor de columpio
• Ejemplo: aislamiento de linfocitos en
gradiente de ficoll
Ultracentrifugación
• Para la separación basada en tamaño, forma y
densidad se utiliza la ULTRACENTRIFUGACIÓN.
• Aquí se requiere utilizar el concepto de
Coeficiente de sedimentación (s): es la
relación entre la velocidad a la que sedimenta
una partícula (V) y la aceleración centrífuga
aplicada: s= V/c d=densidad de la molécula

• donde s= V/c = 2 r2 ( d-do) do= densidad del medio


• 9η n = viscosidad r= radio

• s se da en unidades de tiempo o Sveldberg


• Se cumple:
- La velocidad de sedimentación es proporcional al
tamaño de la partícula
- La velocidad de sedimentación es proporcional a
la diferencia entre la densidad del medio
circundante y la densidad de la partícula
- La velocidad de sedimentación es 0, cuando la
densidad de la partícula e igual a la densidad del
medio circundante
- La velocidad de sedimentación disminuye al
aumentar la viscosidad del medio
- La velocidad de sedimentación aumenta al
aumentar la fuerza del campo centrífugo
Ejemplo
• Hallar el coeficiente de sedimentación deuna
proteína que centrifugada a 60 000 rpm a
20°C manifiesta en el registro óptico un
desplazamiento de 2 mm cada 8 min.
La distancia media de la proteína al eje de
rotación es de 5.86 cm
ω es el ángulo de giro en un
Segundo, o sea 2π radianes
por el número de revoluciones
por segundo
Tiempo de centrifugación
• El tiempo de centrifugación hasta la
clarificación de una organelo se define por:
• t (hs) = K /S
• Donde: S= coeficiente de sedimentación del
organelo
K= constante del rotor. ( depende del
ángulo de inclinación del tubo de
centrifugación con respecto al eje de
rotación)
Tipos de centrífugas
• Analíticas. Utiles para obtener datos
moleculares (Coef. Sedimentación,PM etc)
• Preparativas. Para aislar y purificar muestras.
Hay de 4 tipos:
• De mesa: alcanzan 5000 rpm
• De alta capacidad: Para volumenes grandes.
Max 6000 rpm cap 6 lt
• De alta velocidad: alcanzan hasta 25 000rpm
• Ultracentrífuga: alcanza asta 100 000 rpm
La centrífuga
• Los componentes importantes son el
motor y el rotor.
• Hay dos tipos de rotores:
• Basculantes. Para volúmenes pequeños
y partículas de igual ceoficiente de
sedimentación
• De ángulo fijo. Para volúmenes grandes
En una centrífuga el elemento determinante es
el rotor, dispositivo que gira y en el que se
colocan los tubos. Existen varios tipos :
ma.

NOMOGRAMA