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Producción de Glucoamilasa por Aspergillus niger

Katherine L. Suárez Herencia

Introducción
‡ El desarrollo de tecnologías emergentes implica el reto permanente de utilizar nuevas herramientas de gestión tecnológica. La ingeniería de enzimas y su respectiva tecnología en el contexto de la biotecnología, es una de las áreas del conocimiento sobre las cuales reiterativamente se plantean grandes expectativas como posible generador de ventaja competitiva en economías emergentes. En este sentido, la importancia de producir glucoamilasa a partir de Aspergillus sp. mediante aplicaciones biotecnológicas está dirigida esencialmente al área de alimentos.

Enzimas
‡ Las enzimas son proteínas que actúan como catalizadores de las diferentes reacciones bioquímicas que constituyen el metabolismo de los seres vivos. Para que se produzca una determinada reacción, es necesaria la presencia de una determinada enzima, y la mayor o menor cantidad de ésta suele modificar la velocidad de la reacción controlada.

para fines industriales las más utilizadas son aquellas de origen bacteriano o fúngico. . dando origen a diversos productos que posees una gran relevancia para algunas operaciones y procesos industriales. sin embargo.Amilasas ‡ Las amilasas son enzimas que catalizan las reacciones hidrolíticas del almidón. Las amilasas son comúnmente halladas en animales y plantas.

Se producen por fermentación de una cepa del hongo Aspergillus niger.000 FAU/g aproximadamente equivalen a 10. . entre otros.000 SKB/g. durante 60 minutos a 30°C. es que 1. y es la más utilizada en la fabricación del pan. de que la alfa-amilasa fúngica tiene una mayor tolerancia a la sobredosificación que la de origen cereal. que es la cantidad que dextrinizará una solución estándar de almidón a una velocidad de 1 g/hora a 40°C. SKB que mide la capacidad de la enzima para degradar una solución de almidón puro.5. La relación entre las FAU y las SKB. lo cual produciría migas pegajosas. por lo que no existe el riesgo de que se produzca exceso de dextrinas. Las amilasas de origen fúngico utilizadas en la panadería tienen una actividad variada que va desde baja actividad 2.500 SKB/g hasta alta actividad 50.Tipos de alfa-amilasas ‡ Amilasa de origen fúngico. lo que se basa en su desactivación durante la primera fase de la cocción (60-65°C).000 SKB/g. a un pH de 4. Ello es debido al hecho. como alternativa a la harina de malta. La actividad de las alfa-amilasas de origen fúngico comerciales se mide en dos unidades: FAU (Unidad Fungal Amilasa o Fungal Amylase Unit).

También denominada Glucoamilasa se obtiene del hongo Aspergillus niger.Tipos de alfa-amilasas ‡ La alfa-amilasa Bacteriana. El efecto secundario típico de la amilasa bacteriana es una disminución de la viscosidad del engrudo del almidón. lo que se traduce en una aceleración de la fermentación. Estas amilasas se inactivan a 75°C. y actúa sobre las dextrinas produciendo glucosa. Se produce a partir de la bacteria Bacillus subtilis. y es muy resistente al calor por lo que a temperaturas de 70 a 90°C alcanza su máxima velocidad de reacción. ‡ La alfa-amilasa de origen cereal (harina de malta). ‡ La Amiloglucosidasa. . Su elaboración consiste en la germinación del trigo para que se movilicen las alfaamilasas naturales del grano.

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La Glucoamilasa también reconocida como amiloglucosidasa es una exohidrolasa que en la nomenclatura internacional está identificada como E. un contenido de glucosa del 95 al 97 % en peso y de un 30 a un 5 % de oligosacáridos grandes.2. Los enlaces ramificados -1-4 también se hidrolizan. Es una enzima que tiene como función actuar en la reacción de hidrólisis en cadenas de polisacáridos operando en los enlaces 1.Glucoamilasa ‡ La glucoamilasa es un enzima extracelular producida por diversas especies de Aspergillus. aunque lentamente.3.. pero mucho más lentamente.3. formándose un jarabe de glucosa. La glucosa formada se utiliza como jarabe o se cristaliza para obtener glucosa pura sólida. y su nombre sistemático es 1.4-alfa-D-glucano glucohidrolasa.1.C.4-alfa-D-glucosa separando unidades de glucosa a partir del extremo no reductor de la cadena. ‡ ‡ . La enzima es capaz de hidrolizar también. Debido a esto se le define como una enzima desramificadora. los enlaces a-1-3.

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. siendo máxima sobre almidones previamente sometidos a licuefacción.5. lo que la diferencia claramente de las alfa y beta amilasas. ‡ Las glucoamilasas son inactivas sobre almidón nativo. y temperatura alrededor de 55-65°C. ‡ La amiloglucosidasa se usa a gran escala en la industria de procesado del almidón en tanques discontinuos a 55-60 °C y pH de 4. para transformar las dextrinas formadas por la a-amilasa en glucosa.5 y con períodos de incubación de 48-92 horas. ‡ La Glucoamilasa se encuentra en el mercado tanto en forma sólida como líquida (líquido color marrón claro).Glucoamilasa ‡ El principal producto final de la acción de la glucoamilasa sobre el almidón es glucosa. Su actividad es máxima entre pH 4 y 5. La rata de reacción cae rápidamente a medida que disminuye el tamaño de la molécula de sustrato.

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‡ Fabricación de polvos gastrónomos. etc. ‡ Como reactivo para la determinación de almidones en alimentos. . de ácido cítrico. evitando que se produzca turbidez después de la concentración). de antibióticos. ‡ Fabricación de azúcar de almidón. ‡ Elaboración de la cerveza y fabricación de vinagre (la levadura de la substitución con la enzima puede mejorar la producción). ‡ Fabricación de jarabes de glucosa. ‡ Fabricación de jugos de fruta (hidroliza el almidón.Usos de la Glucoamilasa ‡ Fabricación de alcohol (biocombustibles).

. que usó el nombre "Aspergillum" por parecerse el hongo al instrumento usado para dispersar agua bendita.Aspergillus niger ‡ En 1729 el Aspergillus fue catalogado por primera vez por el biólogo italiano Pier Antonio Micheli.

galactosidasa. ‡ El Aspergillus niger se cultiva para producir varios productos químicos como: ácido cítrico (E330). Puede existir en dos formas básicas: levaduras e hifas.Aspergillus niger ‡ Aspergillus niger es un hongo que produce un moho negro en vegetales -muy común en la lechuga. . etc. y enzimas como: glucoamilasa. Es una de las especies más corrientes del género Aspergillus. el tomate o la acelga-. ácido glucónico (E574).

Clasificación Científica Dominio: Eukaryota Reino: Fungi Filo: Ascomycota Subfilo: Pezizomycotina Clase: Eurotiomycetes Orden: Eurotiales Familia: Trichocomaceae Género: Aspergillus Especie: Aspergillus niger .

yuca. ‡ A. niger usando el método de Fermentación en Estado Sólido (SSF . la preparación enzimática fue capaz de hidrolizar el almidón del maíz y el almidón de otras raíces como el camote. La hidrólisis fue directamente proporcional a la cantidad de almidón de la fuente. niger fue aislado en un medio de agar almidón con azul brillante de Remazol y fue usado como sustrato del proceso de fermentación para la producción enzimática el salvado de arroz suplementado con harina de soya. Con excepción del almidón de cocoñame. .Solid-State Fermentation) y encontrar una caracterización preliminar de la enzima producida.Producción y Caracterización de Amiloglucosidasa extracelular de Aspergillus niger CA-19 mediante Fermentación en Estado Sólido (SSF) ‡ Este estudio fue realizado con el propósito de producir la enzima amiloglucosidasa a partir de A. etc. ‡ El crudo de la enzima extraída tuvo una temperatura y pH óptimos a 60°C y pH 4 respectivamente.

Detección y Aislamiento de la cepa amilolítica de Aspergillus niger ‡ La cepa amilolítica de A. . Nigeria) usando un medio de agar almidón con azul brillante de Remazol. ‡ Las colonias de A. niger fue aislada de muestras de suelos tomadas en diferentes áreas de la UNAAB (University of Agriculture Abeokua. niger que produjeron grandes zonas de aclaramiento fueron tomadas y purificadas sembrándolas en estrías en un agar de extracto de malta. La identificación de este aislamiento se basó en las características morfológicas de las colonias y de las células con referentes en el método de Rasper y Fennel (1965). que fue calculada restando al radio de la zona aclarada el radio de la colonia. La producción de una amilasa fue detectada por la desaparición del color azul del medio alrededor de los lugares de inoculación de las colonias.

La esterilización se hizo a 121°C durante 15 minutos. 0. UK) a 150 rpm.01M (pH4.05% y (NH4)2SO4. 0. esta humedad fue dada con una solución acuosa de sales minerales [MgSO4. El medio estaba constituido de salvado de arroz (10g) y harina de soya (3g) humedecido al 55%. . 0.1%. ‡ La extracción de la enzima del salvado enmohecido se hizo: Para 1g de salvado enmohecido.1%: KH2PO4. FeSO4. fueron agregados 10ml de buffer citrato 0.5) y la mezcla fue removida en un agitador orbital (LABLINE. 0. durante 1 h a 28°C. Después de enfriar los matraces. niger CA-19 (2x106 esporas/100ml) y fue incubado a 30°C durante 72h.7H20.Producción de Amiloglucosidasa por Fermentación en Estado Sólido ‡ La fermentación fue realizada en matraces Erlenmeyer de 250ml. El filtrado fue realizado a partir del caldo obtenido de la fermentación.1%. fueron inoculados con 1ml de suspensión conidial de A. CaCl2.1%]. 0.

Los azúcares reductores fueron calculados por el método del DNS (ácido 3. ‡ Una unidad de actividad de amilasa (FAU) fue definida como la cantidad de enzima que liberó 0. .Prueba de Amiloglucosidasa ‡ La actividad de la Amiloglucosidasa fue probada a 60°C durante 1h usando almidón de maíz al 1% (p/v) en buffer citrato 0.1M (pH4.5).0uL de la mezcla reactiva.5-dinitrosalicílico).1 umol de D-glucosa de almidón en 1.

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la enzima fue incubada con almidón soluble en un buffer de acetato 0. se tomaron alícuotas de solución estándar de amilasa para analizar su actividad.1M. ‡ Efecto del pH: La actividad de la amiloglucosidasa fue medida en varios rangos de pH que fueron de 4 a 10. A diferentes intervalos de tiempo.Caracterización de Glucoamilasa ‡ Efecto de la Temperatura: Para establecer la temperatura óptima de actividad de la amiloglucosidasa. El pH de reacción de la mezcla fue variando conforme se usaban diferentes buffers (buffer citrato para pH=3-6. buffer fosfato para pH=7-8 y buffer borato para pH=9-10) ‡ Estabilidad de la Enzima: La solución enzimática se mantuvo a una temperatura ambiente por 34 días. . en donde las temperaturas de reacción fluctuaron entre 20 y 90°C.

‡ Cromatografía en Capa Fina: Los azúcares producidos por la hidrólisis del crudo de almidón con amiloglucosidasa de A. La solución enzimática (1mL. 1 mL)) y 3mL de cada solución de crudo de almidón fue incubada a 60°C durante 1h.5. ñame y cocoñame. buffer acetato fosfato (pH 4. camote. La solución comercial de almidón fue utilizada como estándar. yuca. niger CA19 fueron identificados mediante Cromatografía en Capa Fina (TLC) usando como fase móvil n-butanol : ácido acético : dietil éter : agua (9:6:3:1). La capacidad de los crudos de almidón para hidrolizarse fue calculada de acuerdo a la cantidad de azúcares reductores (mg g-1) producidos.Caracterización de Glucoamilasa ‡ Digestión de Almidones Primarios: La capacidad del crudo de la enzima para hidrolizar almidones primarios fue estudiado usando almidones de maíz. Los azúcares reductores fueron revelados con un spray de hidrocloruro de p-anisidina. .

‡ En la Fermentación en Estado Sólido. . constituyen la mayor fuente de producción de tipo comercial para enzimas usando la técnica de Fermentación en Estado Sólido.Discusión y Resultados ‡ Es necesario el aislamiento y la selección de los organismos adecuados para la producción de amilasa. la selección de un adecuado sustrato sólido es un punto crítico que involucra la detección de un gran número de materiales agro-industriales para el crecimiento microbiano y la formación de sus productos. ‡ El resultado de este estudio mostró que la capacidad de aislar microorganismos productores de amiloglucosidasa. como el Aspergillus niger. su uso como sustrato para la producción de enzimas lo hace ideal para la producción a gran escala de amilasa por fermentación en estado sólido. Dado que el salvado de arroz es un producto barato y de fácil disponibilidad.

. La actividad de la enzima decayó drásticamente a temperaturas mayores a 60°C y se paralizó totalmente a los 90°C.Caracterización de Glucoamilasa ‡ Los estudios preliminares para caracterizar la enzima por sus actividades enzimáticas mostraron que la amiloglucosidasa producida por Aspergillus niger CA-19 fue óptimamente activa a 60°C.

Al superar el pH 4. . se observó un continuo decaimiento en la actividad de la enzima.0.Caracterización de Glucoamilasa ‡ El resultado mostró que la actividad de la enzima fue óptima cuando el ensayo se llevó a un pH 4.

Hidrólisis del Almidón Crudo ‡ La capacidad de los gránulos de almidón de ser digeridos por la enzima. . depende de la fuente de almidón y de la cantidad de enzima con la que se traten.

. este estudio de producción de amiloglucosidasa por A. 40 y 60 minutos de hidrólisis.0 a 60°C) mostraron que la glucosa fue el único producto obtenido después de 10. indicando que el patrón de comportamiento de la enzima fue completamente el de la amiloglucosidasa.Cromatografía en Capa Fina ‡ Los productos finales determinados mediante la cromatografía en capa fina en óptimas condiciones (pH 4. Este comportamiento resulta en una gran ventaja para la producción industrial de jarabe de glucosa. Así es como. niger CA-19 nos arroja resultados bastante promisorios. 20.

. se hace necesaria ahondar las investigaciones para optimizar el proceso fermentativo para así obtener mayores cantidades de producción de amiloglucosidasa por esta cepa.Generally Recognized As Safe) para elaboración de alimentos. cervezas y aplicaciones farmacéuticas.Conclusiones ‡ Este estudio confirmó que Aspergillus niger es un excelente productor extracelular de amiloglucosidasa. Dado el hecho de que este microorganismo se encuentra en la lista de microorganismos generalmente reconocidos como seguros (GRAS .

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