Hormônios Vegetais produzidos à partir de fermentação de resíduos agroindustriais

Princípios Biotecnológicos

Professor Gessiel Newton Scheider

Equipe de Pesquisa
Sara Mauren Cléia Diana 

               

1893 Koch; Pasteur Processo de fermentação 1898 Shataro Hory fungo Fusario responsável pela transmissão de ´toxina´ no arroz 1902 ± Haberlandt ± totipotencialidade das células vegetais 1919 Karl Ereky Primeira utilização do termo biotecnologia 1920 - germinação e crescimento de orquídeas 1926 ±Went ± descoberta das auxinas 1937 Fritz Went Descoberta da auxina 1939 ± White, Nobercourt, Gautheret ± calos de fumo e cenoura Década de 40 ± água de coco - zeatina 1941 Van Overbeek Aplicação de leite de coco nos meios de cultura in vitro por conter um fator de divisão Década de 50 seleção de cepas produtoras de giberelinas 1954- Torrey ± suspensões celulares 1955 ± Miller et al. - descoberta das citocininas 1957 ± Skoog & Miller ± Auxina 1962 - Desenvolvimento de meio artificial (Murashige e Skoog) 1957 Skoog e Miller Descoberta da regulação da formação de orgãos 1974 Zaenen et al.; Descoberta do que o plasmídeo Ti é o princípio indutor de tumor de Agrobacterium

AUXINAS

GRAVITROPISMO E FOTOTROPISMO

AUXINAS

EFEITOS

Auxina A acidificação da parede celular estimula ao crescimento

Estrutura química Auxina

Ação de Plasmodiophoromycetes brassicae

Substitutos para Auxina

Gibberella fujikuroi

Histórico Giberelina GA3

Síntese de GA

GA4 GA7

Giberelinas Efeitos
GA5:

GA3:

Apenas florescimento no Joio, não crescimento

Efeitos Giberelina

Forma juvenil /Forma adulta de Eucaliptus

Giberelina Efeitos

Giberelina Estrutura química 
20 átomos de carbono tetracíclico ou 19 átomos (as mais ativas)

Inibidores para Biossíntese da GA
AMO 1618 Paclobutrazol: Florescimento;indução de frutos Uniconazole: no solo, reduz em mais de 50% a altura das plantas.

´Melhoramento do trigo e arroz (1960), com plantas anãs de alta produtividade na América Latina e Sudoeste da Ásia para sustentação ao crescimento populacional´ (Hedden,2003) Dr. Normam Borlaug: Prêmio Nobel- eluciadação dos mecanismos que controlam o crescimento dos cereais, regulado por GA.

Revolução Verde

RHt-gene responsável pela mutação semidominante de altura reduzida (recuced height)

CITOCININA

Esperma de arenque-1940-50 (Folke e Skooge) Cinetina não é um regulador natural de crescimento vegetal

Citocinina Estrutura Química
Aquecimento do DNA: Lethan(1973) Natural nas plantas Milho (Zea mays)

Zeatina
Embriões, folhas e frutos jovens Mais ativas:Trans
Todas citocicinas naturais são derivadas da aminopurina: 6BA, cinetina, 2iP e trans-zeatina

Citocininas sintéticas
Desfolhante

Retardamento da senescência

Citocinina Efeitos
Gemas em musgos Raízes e Parte aérea

Citocininas/Auxinas
Diferenciação em culturas (citocinina / auxina)
Cinetina > AIA = formam gemas Cinetina = AIA = formação de callus Cinetina < AIA = formação de raízes

Dormência: quebra dormência de gemas (AIA / citocinina) AIA > citocinina = dormente AIA < citocinina = atividade

Agrobacterium expressando a citocinina

Citocininas
Citocininas ocorrem de forma livre e essa é a forma ativa (Yamada et.al,2001) E ocorrem em RNAt de bactérias e humanos e em alguns nucleotídeos, cuja base foi modificada

Os genes presentes no T-DNA passam a expressar-se, codificando enzimas envolvidas na via de biossíntese de reguladores de crescimento (auxinas e citocininas). (Andrade, G. et. al, 2003)
Plantas transformadas com rolB apresentam um estado hiperauxínico (Caponeet al., 1989). Plantas transformadas com rolC apresentam mais expressão de citocininas.

Citocinina produzida por A. tumenfaciens e Corynebacterium fascians (vassoura-da-bruxa)

Galhas em planta atacada por inseto 

Agrobacterium rhizogenes
Culturas in vitro de raízes transgênicas, obtidas a partir de germinantes transformados com Agrobacterium rhizogenes, são mantidas em diversas condições de crescimento. Os óleos essenciais isolados dessas culturas são comparados com os obtidos a partir da planta-mãe

ETILENO

ETILENO EFEITOS

ETILENO EFEITOS

ETILENO
Acredita-se que enfiando pregos na jabuticabeira ela produz frutos mais rápido. Na verdade, quando se provoca este tipo de ferimento na planta, ocorre um estímulo e ela produz o etileno, que a induz a florescer.

ETILENO ESTRUTURA QUÍMICA
A partir do aminoácido metionina

Etefon

Etileno

Ácido 2-cloroetil fosfonico

Etileno

ÁCIDO ABSCÍNICO HISTÓRICO
Bennet-Clark e Kefford (1953) ± inibidor & isolados de gemas axilares eram responsáveis pela dominância apical e manutenção de Dormência em batatas Frederick T. Addicott e colaboradores (1963) - abscin I e Abscin II responsáveis pela abscisão de frutos de algodão (Gossypim hirsutum L.) Philip F. Wareing (1963) - dormina ± causavam dormências em Acer pseudoplatanus Van Stevenick (1963) - lupine ± acelerava a abscisão de flores e Frutos jovens de Lupinus luteus (tremoço) 1964- Fisiologistas vegetais chegaram a conclusão que: abscin II = dormina = lupine = ácido abscísico (ABA)

ÁCIDO ABSCÍNICO ESTRUTURA QUÍMICA

ÁCIDO ABSCÍNICO EFEITOS

Abscisão

Indução e manutenção da dormência em gemas e sementes

Plantas em estresse hídrico. A : expressão maior ABA B : normal

RESUMINDO

Sintetizam hormônios vegetais
Fungos filamentosos Aspergillus flavus Gibberella fujikuroi A. fumigatus G. lateritium Boletus elegans G. zeae Botryodiploidea theobromae Geophito fusicularis Choetomium sp. Geopetalum geogenium Clitocybe dicolor Crifola freudosa Clitopilus pinsitus Hypholama fasciculase Colletotrichum sp. Lisea fujikuroi Collybia conigena Nectria galligena Fusarium avenaceum Neurospora crassa F. cucurbítae Penicillium sp. F. culmonum Phallus impudicus F. herbanum Phellinus pomaceous F. heterosporum Mizoetonia solani F. moniliforme Schizophyllum commune F. moniliforme var. anthophillum Sphaceloma manihoticola F. maniliforme var. majus Verticillium albo-atrum F. moniliforme var. subglutinans V. lateritium F. oxysporum V. nigrescens F. Solani V. dahliae Actinomicetos Actinomyces sp. Nocordia sp. Leveduras Candida pulcherrima Torulopsis sp. Torula pulcherrima (Kumar e Lonsane ± Microbial Production of Gibberellins: State of the Art; Advances in Applied Microbiology, 34,1989. ) Bactérias Achromobacter sp. B. megaterium Agrobacterium tumefaciens B. pumilis A. radiobacter B. polymyxa Alcaligenes sp. Brevibacterium sp. Arthobacter sp. Flavobacterium sp. Arthobacter globiformis Pseudomonas fluorescens Azotobacter vinelandii P. liquefaciens Bacillus licheniformis P. desmolytica B. cerpus P. aeruginosa

Alelopatia aplicada
Preparados biodinâmicos ricos em fitormônios (década de 20) Silagem aeróbica de capim-elefante com inoculante microbiano produzem reação de fermentação que produzem hormônios vegetais (Higa, 1992) Uma mistura de B. pumilus, B. subtilis e Curtobacterium flaccunfaciens aplicada sobre sementes estimula o crescimento de plântulas de pepino e reduzem sintomas causados por patógenos.

Alelopatia aplicada
Chorume de urtiga (Peterson e Jensen 1985 e 1986)

Gramíneas dandá e tiririca: elevada produção de fitormônio Indolbutírico

1kg Dandá ou Tiririca 250 mL + Álcool+ 1L Água PROCEDIMENTO: Moer ou macerar bem os bulbos (batatinhas) com as folhas e colocar na água durante 48 horas, em seguida, coar e colocar no álcool.

DESENVOLVIMENTO DE BIOPROCESSO PARA PRODUÇÃO DE HORMÔNIO VEGETAL (ÁCIDO GIBERÉLICO ± GA3) POR FERMENTAÇÃO NO ESTADO SÓLIDO EM RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS BRASILEIROS: RELAÇÃO DA PRODUÇÃO DE GA3 EM BIORREATOR PILOTO E BIOENSAIOS EM MUDAS DE TOMATEIRO (Lycopersiicum escullenttum)

Dra. Cristina Maria Monteiro
Machado

Dr. Carlos Ricardo Soccol

Sistema FES horizontal
O termo fermentação em estado sólido, ou fermentação semi-sólida, ou fermentação em ‡ ‡ ‡ ‡ meio semi-sólido aplica-se ao processo de crescimento de microrganismos sobre substratos sólidos sem a presença de água livre. A água presente nesses sistemas encontra-se ligada à fase sólida, formando uma fina camada na superfície das partículas.(Raimbault, 1998)
A fase sólida atua como fonte de carbono, nitrogênio e demais componentes. O ar, necessário ao desenvolvimento microbiano, deve atravessar os espaços vazios do meio a pressões relativamente baixas além de servir como suporte para o crescimento das células microbianas. . O substrato não deve apresentar aglomeração das suas partículas individuais. O crescimento microbiano ocorre em condições mais próximas às dos habitats naturais.

O meio apresenta alta heterogeneidade e os substratos não estão completamente acessíveis ao microrganismo.

PDA Gibberella fujikuroi LPB-06

PDA

5 pellets de PDA fermentado

Crescimento 32ºC/8dias Conservação 4ºC 3meses

50 mL de meio Czapek Dox Shaker 200rpm 30ºC/4dias Conservação 4ºC/30dias

15%(m/V) de solução semente

Fermentação 6 dias T= 29ºC 5.0<pH>5.4 Aeração e umidade variáveis

Substrato Sólido

Homogeneizar

Fração extração(g)

Material fermentado 2 mL sol ZnAc Repouso 2min 2mL KFeCN Completar com água Misturar Repouso 2min

Tampão Fosfato pH 7.4 V (mL) = m/2

2X

30mL 20min 200rpm

Solução clarificada p/ análise

Balão volumétrico 50mL c/ 10mL etanol absoluto

Extrato

Aeração e umidade diferentes em cada processo CÁLCULOS CINÉTICOS

dX = F(X , S,T,...) dt X: concentração de biomassa (gbiomassa.l-1 ou gbiomassa.kg-1); t: tempo (h); S: substrato ((g MS).l-1 ou (g MS).kg-1); T: temperatura (ºC)

CRESCIMENTO BIOMASSA
=
max

S KS + S

: taxa de crescimento específico (h-1); max : taxa de crescimento específico máximo (h-1); S : concentração de substrato (g.l-1); Ks : constante de afinidade biomassa/substrato

=1 dX X dt X : concentração da biomassa em um determinado tempo (g.l-1).
X t

´X0 dX = ´ dt X ln X = t X0 X : concentração da biomassa no tempo t (g.l-1). X0: biomassa inicial de concentração no t = 0 (g.l-1); : taxa de crescimento específico na fase exponencial (h1); t: tempo correspondente à concentração da biomassa X (h)

x = 2X0 e t0 = 0 Assim:

t = ln 2
d max

P= x Y =X -X S -S
X/ S S 0 0

1

YX/S : rendimento biomassa/substrato consumido (adimensional); S0: concentração inicial do substrato (g.l-1); S : concentração final do substrato (g.l-1); X0: concentração inicial de biomassa (g.l-1); X : concentração inicial de biomassa (g.l-1).

CÁLCULOS RESPIROMÉTRICOS
Ar puro: 21 e 79% respectivamente para O2 e N2

VO2e = [21] . Fe 100 VN2e = [79] . Fe 100 VO2e : vazão volumétrica de oxigênio na entrada do fermentador (l.h-1); VN2e : vazão volumétrica de nitrogênio na entrada do fermentador (l.h-1); Fe : vazão de ar na entrada do fermentador (l.h-1).

VO2s = [%O2S] Fs 100 VO2e = [21] . Fe ± [% O2 S].FS 100 100 A relação entre o Fe e Fs pode ser obtida a partir do fato que o N2 do ar não é consumido no processo e portanto: VN2e = VN2s Fe = Fs [100 -%O2s - %CO2s] 79 CNTP (273 K e 1 atm) 1 mol de qualquer gás ocupa um volume de 22,4L F corr = F[T] 273

CÁLCULOS FINAIS
VO2e = [0,21 ± 0,79%O2] . Fcorr 100 -%O2-%CO2 VCO2s = [0,79%CO2] . Fcorr 100 -%O2-%CO2

Qr = CO2 produzido O2 consumido Qr = quociente respirométrico

BIOTRANSFORMAÇÃO DE ESTEVIOSÍDEO PARA PRODUÇÃO DE COMPOSTO SIMILAR A GA3 Marcio Chimelli
Stevia rebaudiana Bertoni

SELEÇÃO DE Bacillus spp PROMOTORES DE CRESCIMENTO DE MILHO Renato Tadeu Guerreiro
Centrifugado 10000 x g/10 min sobrenadante.

Resultado do experimento
³A produção de AIA pelas bactérias in vitro não 28º C/escuro/agitação constante/24 horas foi um parâmetro fundamental para o desempenho dos melhores isolados bacterianos na inoculação do milho.´

meio líquido TSB (Trypticase Soy Agar)

Detecção quantitativa de AIA: Leitura: absorbância em
5 mL de reagente Salkowski + 1 ml do sobrenadante da cultura 500 nm/após 30min

Justificativa Patten e Glick (1996):

A entrada adicional de AIA microbiano pode modificar a auxina endógena para nível ótimo ou acima do ótimo, resultando na indução ou inibição do crescimento da planta. A resposta da auxina pode ser dependente do estágio de desenvolvimento da raiz da planta, o qual influi na composição e quantidade dos exudatos (PILET et al. 1979).

Bioestimulantes e Protetores de Plantas Derivados de Macroalgas Marinhas
Viviane Talamini, Roberta Paulert e Marciel Stadnik Padina pavonia

Inibem o crescimento micelial e a germinação de esporos fúngicos ou a multiplicação de bactérias e outros fitopatógenos Contêm moléculas bioativas capazes de induzir ou ativar os mecanismos de defesa das plantas e/ou atuando no estimulo da população de antagonistas do solo  Bioestimulantes do crescimento das plantas Contêm: Auxinas, giberelinas, precursores do etileno e betaínas, que podem atuar no crescimento das plantas (Wu et al., 1997). Resultado da pesquisa: Reduziram a infecçãodas raízes de Abelmoschus esculentus por Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani e Fusarium solani e ainda houve maior crescimento das plantas (Sultana et al., 2005).

Controle da Podridão de raiz e Promoção de Crescimento Hidroponia com bactérias
Élida Barbosa Corrêa e Wagner Bettiol

em

‡

Paulitz et al. (1992), García et al. (2004), Yang et al. (2004), McCullagh et al. (1996) e Van Peer & Schippers(1988). Paulitz et al. (1992):

Pseudomonas spp em pepino hidropônico promove o desenvolvimento do sistema radicular em 134%. ‡ Yang et al.(2004):

Isolado PKB1 de Paenibacillus polymyxa: aumenta produtividade em pepinos. Pseudomonas fluorescens (63-49) promoveu o crescimento de plantas de pepino hidropônico e aumentou a sua produtividade. ‡ Van Peer & Schippers (1988):

Em tomate hidropônico: Pseudomonas spp. promoveram o crescimento das plantas, aumentando a massa do sistema aéreo e radicular. ‡ García et al. (2004):

A adição de suspensões de 108 células/ml de Bacillus licheniformis por planta em sistema hidropônico proporcionou aumento na produtividade e no diâmetro dos frutos de tomate.
Bioprodutos formulados com bactérias: Companionâ® (Growth Products, White Plains, New York, EUA) formulado com Bacillus spp.

Minhocultura e produção de húmus para a agricultura familiar
Gustavo Schiedeck, Márcio de Medeiros Gonçalves e José Ernani Schwengber
O húmus possui uma grande quantidade de hormônios vegetais importantes para o crescimento e desenvolvimento das plantas

Hormônios em Pseudomonas spp.
Rita de Cássia Madail Santin
Ácido Indolacético (AIA): Produto obtido por fermentação,a partir da cepa de bactérias Rhizobium sp; Ácido jasmônico: Obtido a partir de processo fermentativo estático do fungo Botryodiplodia theobromae, que contém biojás.

CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS DOS GÊNEROS PSEUDOMONAS COMO BACTÉRIAS PROMOTORAS DO CRESCIMENTO DE PLANTAS (BPCP)
Agenor de Castro M. Dos Santos Júnior, César Raphael Fernandes da Silveira, Geovane Silvano e Cláudia Cristina M. Didonet Souza

Os 24 isolados do gênero Pseudomonas crescidos em ausência de triptofano, não foram capazes de produzir AIA. Já quando cultivados em meio enriquecido com triptofano,apenas dois isolados não produziram AIA (S5 e S15) e a produção média dos demais foi de 3,38 g mL-1. Apesar da baixa produção média de AIA dos isolados, esta pode ser mais adequada para promover os efeitos nas plantas já que é um fotohormônio e as altas concentrações podem ter efeitos negativos. (TAIZ & ZEIGER, 2004).

APLICAÇÃO FOLIAR DE EXTRATO DE ALGA, ÁCIDO L-GLUTÂMICO E CÁLCIO EM FEIJOEIRO Átila Francisco Mógor, Elizabeth Orika, João Domingos Rodrigues e Gilda Mógor
SANDERSON et al. (1987); REIBER e NUEMAN (1999); ZHANG e SCHMIDT (2000): Alga Ascophyllum nodosum

Descreveram o extrato de alga como sendo uma fonte natural de citocininas, classe de hormônios vegetais que promovem a divisão celular e retardam a senescência. (MUSGRAVE, 1994).

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