Validasi Metode Analisa

oleh
DIAN NOVITA SARI
16061030040021
Metode Validasi
Tujuan dari pelaksanaan Validasi Metode Analisa (VMA) adalah untuk
menunjukkan bahwa semua metode tetap yang digunakan sesuai dengan tujuan
penggunaannya dan selalu memberikan hasil yang dapat dipercaya. Jadi, dalam
Validasi metode analisa yang diuji atau divalidasi adalah PROTAP (prosedur tetap)
pengujian yang bersangkutan. Misalnya, “Validasi Metode Analisa Penetapan Kadar
Zat Aktif Paracemol dalam Tablet Biogesic® dengan Metode Spektrofotometri
UV/Vis”, maka yang divalidasi atau diuji validitasnya adalah Prosedur Tetap
“Penetapan Kadar Zat Aktif Paracemol dalam Tablet Biogesic® dengan Metode
Spektrofotometri UV/Vis”.
 Tahapan-tahapan Validasi
1. Accuracy (kecermatan)
• Merupakan kemampuan suatu metode analisa untuk memperoleh nilai yang
sebenarnya (ketepatan pengukuran). Terdapat 5 metode penentuan akurasi
untuk penetapan kadar bahan aktif obat dalam bahan baku dan produk obat,
yaitu :
1. Menggunakan metode analisis untuk menetapkan kadar analit dalam bahan
baku berkhasiat yang diketahui kemurniannya (misalnya bahan baku
pembanding sekunder).
2. Bahan baku berkhasiat atau cemaran dalam jumlah yang diketahui
ditambahkan kedalam plasebo. Metode analisis ini akan digunakan untuk
penetapan kadar bahan baku berkhasiat/cemaran dalam produk obat.
3. Bila plasebo tidak bisa diperoleh, verifikasi akurasi metode dapat dilakukan dengan
teknik standar adisi, yaitu dengan menambahkan sejumlah tertentu analit kedalam
produk obat yang telah diketahui kadarnya. Metode analisis ini digunakan untuk
penetapan kadar bahan baku berkhasiat/cemaran dalam produk obat

4. Menambahkan cemaran dalam jumlah tertentu ke dalam bahan baku berkhasiat/produk

obat. Metode analisis ini digunakan untuk penetapan kadar cemaran dalam bahan baku
berkhasiat dan produk obat.

5. Membandingkan dua metode analisis untuk mengetahui ekivalensinya, yaitu

membandingkan hasil yang diperoleh dari metode analisis yang divalidasi terhadap hasil
yang diperoleh dari metode analisis yang valid (akurasi metode analisis yang valid ini
telah diketahui). Metode analisis ini digunakan untuk penetapan kadar bahan baku
berkhasiat dalam bahan baku berkhasiat, produk obat dan penetapan kadar cemaran.
• Akurasi dinyatakan sebagai prosentase (%) perolehan kembali (recovery).

• Akurasi dinilai dengan menggunakan sedikitnya 9 penentuan dengan sedikitnya 3 tingkat

konsentrasi dalam rentang pengujian metode analisis tersebut (misalnya 3 konsentrasi/3
replikasi untuk tiap prosedur analisis lengkap).

• Ketepatan metode analisa dihitung dari besarnya rata-rata (mean, x) kadar yang
diperoleh dari serangkaian pengukuran dibandingkan dengan kadar sebenarnya.

• Syarat recovery : 98 – 102 %

2. Precision ( ketelitian)

• Merupakan kemampuan suatu metode analisis untuk menunjukkan kedekatan dari

suatu seri pengukuran yang diperoleh dari sampel yang homogen.

• Terdapat 3 kategori pengujian presisi, yaitu :

• Keterulangan (repeatability), dinilai dengan menggunakan minimum 9 penentuan
dalam rentang penggunaan metode analisis tersebut (misalnya 3 konsentrasi/3
replikasi).
• Presisi Antara, yaitu perbedaan antar operator/analis dengan sumber reagensia dan
hari yang berbeda.
• Reprodusibilitas, dengan menggunakan beberapa laboratorium untuk validasi metode
analisis, agar diketahui pengaruh lingkungan yang berbeda terhadap kinerja metode
analisis.
•Presisi dinyatakan dalam bentuk RSD (relative
standart deviation) atau SRB (sebaran baku relatif) .
•Persyaratan RSD sebagai berikut :
3. Selektivitas (Spesifisitas)
• Merupakan kemampuan suatu metode analisa untuk membedakan senyawa yang diuji
dengan derivat/metabolitnya.
• Adanya perbedaan nyata antara resolusi antara dua puncak yang berdampingan dan
kemurnian tiap puncak dalam kromatogram.
• Untuk HPLC, Rs : 1,2 – 1,5.

• Untuk Spektrofotometer UV/Vis: jarak dua puncak berdampingan: resolution factor (Rf)
> 2,5.
• Lakukan scanning (pemindaian) sampel yang diuji lihat kromatogram dari dua puncak
yang berdekatan (Rs) harus tidak kurang dari 1,5 atau terlihat adanya puncak yang terpisah
dari scanning dengan spektrofotometer UV/Vis.
• Pemisahan dua puncak yang berdekatan dalam kromatogram, resolusi (R) ditentukan
dengan persamaan :
Di mana, t2 dan t1 adalah waktu retensi dua komponen, W1 dan W2 adalah lebar puncak.
Komponen pertama dan komponen kedua yang diukur dengan jalan ekstrapolasi sisi
puncak yang relatif lurus sampai garis dasar (base line).

Resolusi harus lebih besar dari 1,5.

Hasil Kromatogram Uji Selektifitas/Spesifitas yang memenuhi persyaratan

Sumber : https://priyambodo1971.wordpress.com/
• Hasil Kromatogram uji selektifitas yang tidak memenuhi persyaratan

Sumber : https://priyambodo1971.wordpress.com/
4. Linearitas dan Rentang

• Merupakan kemampuan suatu metode analisa untuk menunjukkan hubungan secara

langsung atau proporsional antara respons detektor dengan perubahan konsentrasi
analit
• Diuji secara statistik, yaitu Linear Regression (y = a + bx); dimana b adalah kemiringan
slope garis regresi dan a adalah perpotongan dengan sumbu y.

∑ (x – Xbar)(y- Ybar)

Koefisien korelasi (r) = —————————

√[ ∑ (x –Xbar)∑ (y- Ybar)]

Keterangan :

x = pengukuran individual dalam N

pengukuran x (bar)= nilai rata-rata pengukuran

Y = nilai individual sebenarnya dalam N

y (bar) = nilai rata-rata sebenarnya.

•Pengujian dilakukan paling tidak dengan menggunakan 5 kadar yang berbeda, kemudian
dilihat apakah memberikan respons yang linear apa tidak, yang ditunjukkan dengan nilai r
≥ 0,98.
5. Batas Deteksi (Limit of Detection) dan Batas Kuantitasi (Limit of Quatification)

a. Batas Deteksi (Limit of Detection/LOD)

•Merupakan jumlah analit terkecil yang masih bisa dideteksi namun tidak perlu dapat terukur.

•Beberapa pendekatan yang dapat digunakan untuk menentukan batas deteksi tergantung pada
jenis metode analisis apakah metode analisis instrumental atau noninstrumental.

1. Berdasarkan evaluasi visual

Evaluasi visual dapat digunakan untuk metode analisis noninstrumental, tapi dapat juga
digunakan untuk metode analisis instrumental. Batas deteksi ditentukan dengan melakukan
analisis terhadap sampel yang diketahui konsentrasinya dan menetapkan
kadar terendah yang dapat dideteksi dengan baik.
2. Berdasarkan rasio signal terhadap noise
Pendekatan ini hanya dapat diterapkan pada metode analisis yang memberikan
baseline noise. Penentuan signal to noise dilakukan dengan membandingkan
pengukuran signal sampel yang diketahui mengandung analit dalam konsentrasi
rendah dan blanko, kemudian dapat ditetapkan konsentrasi minimum analit yang
dapat dideteksi dengan baik. Rasio signal to noise sama dengan 3 atau 2 : 1 umumnya
dianggap dapat diterima untuk memperkirakan batas deteksi.

• Simpangan respon dan

kemiringan (“slope”)
kurva kalibrasi
Batas deteksi dapat
dinyatakan sebagai :
b. Batas Kuantitasi (Limit of Quantitation/LOQ)
• Merupakan jumlah analit terkecil yang yang masih bisa diukur dengan akurat (tepat)
dan presisi (teliti)/reprodusible.
• Beberapa pendekatan yang dapat digunakan untuk penentuan batas kuantitasi
tergantung pada jenis metode analisis instrumental atau noninstrumental.

1. Berdasarkan evaluasi visual

Evaluasi visual dapat digunakan untuk metode analisis noninstrumental, tapi dapat
juga digunakan untuk metode analisis instrumental. Batas kuantitasi ditentukan
dengan melakukan analisis terhadap sampel yang diketahui konsentrasinya dan
menetapkan kadar terendah analit yang dapat ditentukan secara kuantitatif dengan
akurasi dan presisi yang dapat diterima
2. Berdasarkan rasio signal terhadap noise :
Pendekatan ini hanya dapat digunakan pada metode analisis yang memberikan baseline
noise. Penentuan rasio signal terhadap noise dilakukan dengan membandingkan signal yang
diukur dari sampel yang mempunyai konsentrasi analit yang rendah dan blankonya,
kemudian ditentukan konsentrasi terendah analit yang dapat ditetapkan secara kuantitatif
dengan baik, umumnya pada rasio signal terhadap noise 10:1.
3. Simpangan baku dari respon dan
kemiringan (slope) kurva kalibrasi
Batas kuantitasi dapat dinyatakan
sebagai :
6. Ketangguhan metode (ruggedness)

Ketangguhan metode adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari
analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti
laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari yang berbeda, dll.
Derajat ketertiruan hasil uji kemudian ditentukan sebagai fungsi dari variabel
penentuan. Ketertiruan dapat dibandingkan terhadap keseksamaan penentuan
di bawah kondisi normal untuk mendapatkan ukuran ketangguhan metode.
Perhitungannya dialakukan secara statistik menggunakan ANOVA pada kajian
kolaboratif yang disusun oleh Youden dan Stainer.
7. Kekuatan (Robustness)
• Merupakan kapasitas suatu metode analisis untuk TIDAK terpengaruh oleh variasi-
variasi kecil dalam parameter metode analisa.
• Contoh variasi kecil dalam metode analisa secara HPLC, antara lain: pH fase gerak, suhu,
tekanan, stabilitas, jumlah pelarut organik yang dimodifikasi, konsentrasi buffer,
konsentrasi additive, flow rate, suhu kolom, dan lain-lain.