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Cultivo y conservación de

Microorganismos
Técnicas de aislamiento
Técnicas de aislamiento

• Siembra
• Introducir artificialmente una porción de muestra
(inóculo) en un medio adecuado, con el fin de
iniciar un cultivo microbiano.
• Medio líquido, sólido o semisólido
• Punta, asa, hisopo o pipeta estéril
Técnicas de aislamiento
• Aislar:
Separar un tipo de microorganismo a partir de una población
que los contiene de varios tipos.

• Cultivo:
Es el crecimiento de poblaciones microbianas en ambientes
artificiales (medios de cultivo) bajo condiciones de
laboratorio.

• Cultivo mixto:
Población que contiene microorganismos de diferente
género y especie

• Cultivo puro o axénico:


Población de microorganismos de la misma especie que
proceden de una única célula
Técnicas de aislamiento

• Unidad Formadora de Colonias (UFC)


Una célula, grupo de células o espora de la
misma especie que dan origen a una colonia.

• Colonia
Grupo de células de la misma especie que
proceden de una célula, varias células u
espora (UFC)
Técnicas de aislamiento
• Objetivo:
Separar a los microorganismos a partir de una
mezcla
Aislamiento
Implica los siguientes pasos:

a) Enriquecimiento

b) Aislamiento por estrías en medios


selectivos y diferenciales

c) Re-aislamiento (medio no selectivo)

d) Identificación
Técnicas de aislamiento

• Método de las Diluciones


a) Dispersión en superficie con varilla acodada
b) Vaciado en placa

• Método de la estría cruzada


Método de las Diluciones
Método de las Diluciones

a) Dispersión
con varilla
acodada

b) Vaciado en
placa
Método de las Diluciones
• Fórmulas

• Diluciones decimales:
UFC = No. col (1/dilución) (1/Alícuota)

• Diluciones No decimales
UFC = No. col (Factor de dilución) (1/Alícuota)
Equipo utilizado
Cuenta colonias
Método de la Estría Cruzada
Método de la Estría Cruzada
• Estría cruzada • Diluciones
Ventaja desventaja Ventaja desventaja
Reglas para la elaboración de las
diluciones
 1. La muestra puede ser líquida o sólida.
 2. Solo se adiciona muestra al primer tubo.
 3. La muestra se conocerá como soluto en las diluciones.
 4. El liquido a utilizar para diluir se conocerá como diluente.
 5. Las diluciones podrán ser: Decimales o No Decimales.
 6. Calcular el Factor de Dilución total de la muestra.
 7. Diseñar el esquema de diluciones a realizar (determinar el
Factor individual y el Factor acumulado de las diluciones en
tubo o en placa).
 8. Determinar conc. De MO´s o producto con base a las
fórmulas
Reglas para resolver problemas de
diluciones
 1. Leer el texto del problema y escribir los datos que nos proporciona.
 2. Elaborar un esquema (tipo tabla), de las diluciones propuestas.,
incluyendo las diluciones a sembrar en medio de cultivo sólido
 3. Determinar:
 A) Factor total, Dividir la concentración original entre la concentración a la que
se quiere llegar.
 B) Factor individual, sumar el volumen del soluto y el volumen del diluente y
dividir ambos entre el volumen del soluto.
 C) Factor acumulado, multiplicar el factor individual del tubo inicial por el
factor individual del segundo tubo, multiplicar el factor acumulado del
segundo tubo por el factor individual del tercer tubo y así sucesivamente.
 4. Contabilizar el número de colonias de la placa a una dilución que
contenga entre 25 y 250 colonias
 5. Aplicar la fórmula de determinación de UFC (decimales o No
decimales)
Técnicas de siembra
• Asa,
• Picadura,
• Pipeta,
• Pipeta Pasteur,
• Impronta,
• Réplica
Técnicas de Siembra
• El asa
Estría abierta en
Tubo con medio
inclinado
Estría cruzada

Siembra por picadura


Técnicas de siembra
Siembra por cuadrantes Estría abierta

Estría Cruzada Siembra masiva


Técnicas de siembra

Vaciado en placa Dispersión en superficie

Por Réplica
Aislamiento
Condiciones de Incubación
para el desarrollo de un microorganismo:

• a) Temperatura
• b) pH
• c) Gases (O2, CO2, etc.)
• d) Nutrimentos
• e) Solutos especiales
• f) Tiempo
Clasificación de los microorganismos según su
consumo de oxígeno

1) Aerobio estricto u obligado

2) Microaerofílico

3) Anaerobio Facultativo

4) Anaerobio aerotolerante

5) Anaerobio estricto u obligado


Clasificación de los microorganismos según su
consumo de oxígeno
• Microorganismo Aerobio Estricto
Microorganismos capaces de crecer con la
concentración de oxígeno que existe en la atmósfera
(21%).

Sistema enzimático de destoxificación de productos


tóxicos del metabolismo del oxígeno

Micrococcus luteus
Clasificación de los microorganismos según su
consumo de oxígeno
• Productos tóxicos:
H2O2, O2-, OH., O2.

• Sistema enzimático
Catalasa, Peroxidasa, Superóxido dismutasa
Clasificación de los microorganismos según su
consumo de oxígeno
• Microaerofílicos
Microorganismos aerobios que utilizan el oxígeno a una
tensión más baja que la que existe en el aire (2-10%).

Limitada capacidad de respirar o enzimas sensibles al


oxígeno
Spirillum volutans
Clasificación de los microorganismos según su
consumo de oxígeno
• Anaerobio Facultativo
Microorganismos que pueden crecer en
ausencia o en presencia de oxígeno.

No requieren del oxígeno, pero crecen mejor


en su presencia

Escherichia coli
Clasificación de los microorganismos según su
consumo de oxígeno
• Aerotolerantes

Son microorganismos que pueden tolerar o


soportar el oxígeno y crecer en su presencia
aún cuando no lo utilizan en su metabolismo.

Streptococcus pyogenes
Clasificación de los microorganismos según su
consumo de oxígeno
• Anaerobios estrictos
Microorganismos que no pueden utilizar el
oxígeno como aceptor final de electrones,
debido a que carecen de un sistema
enzimático para destoxificar los productos
tóxicos del oxígeno

Clostridium botulinum
Formas tóxicas del oxígeno
Clasificación de los microorganismos según su
consumo de oxígeno
Clasificación de los microorganismos según su
consumo de oxígeno
Clasificación de los microorganismos según su
consumo de oxígeno
• Microorganismos Capneícos

• Microorganismos que requieren de una


atmósfera de CO2 para su crecimiento
requieren de estufas especiales
Grupo Relación con el Tipo de Ejemplo Habitat
O2 metabolismo

AEROBIOS
Obligados Lo requieren Respiración Micrococcus Piel
aeróbica luteus

Facultativos No lo requieren Respiración Escherichia coli Instestino


pero crecen aeróbica, delgado de
mejor en su anaeróbica y mamíferos.
presencia. fermentación

Microaerofílico Lo requieren Respiración Spirillum Lagos


pero a niveles aeróbica volutans
menores que el
atmosférico
ANAEROBIOS
Aerotolerantes No lo requieren Fermentación o Streptococcus Tracto
y no crecen respiración pyogenes respiratorio
mejor en su anaeróbica superior
presencia
Obligados Dañino o letal Respiración Clostridium Suelo, fango.
anaeróbica o botulinum
fermentación
Aislamiento de
Microorganismos Anaerobios
Técnicas de aislamiento para Microorganismos
Anaerobios
 Adición de sustancias reductoras: Tioglicolato de sodio, Cisteína
 Caldo carne cocida
 Comensalismo
 Jarra de anaerobiosis
- Sistema Gas Pak o Anaerogen
- Intercambio gaseoso
Desplazamiento del oxígeno por otros gases (H2, N2 o CO2)

Accesorios adicionales:
 Uso de tubos con tapón de rosca,
 Sello de aceite mineral,
 Calentamiento previo a la inoculación,
 Tubos de 16X150 mm con ¾ de medio de cultivo,
 Cámara de anaerobiosis
Adición de sustancias reductoras

• Caldo Tioglicolato • Caldo Carne Cocida


Extracto de levadura 5.0 g Corazón de bovino 30.0 g
Casitona 15.0 g Proteosa Peptona 20.0 g
Dextrosa 5.0 g Dextrosa 2.0 g
Cloruro de sodio 2.5 g Cloruro de sodio 5.0 g
L-cisteína 0.5 g Agua c.b.p. 1.0 L
Ácido Tioglicólico 0.3 g
Agar 0.75 g pH 7.4
Resazurina 0.001 g
Agua c.b.p. 1.0 L Aceite mineral 0.5-1.0 mL

pH 7.1
ADICIÓN DE
SUSTANCIAS
REDUCTORAS

AEROBIO ANAEROBIO
FACULTATIVO
Jarra de anaerobiosis
Gas Pak
Borhidruro de sodio - NaBH4
Bicarbonato de sodio - NaHCO3
Ácido Cítrico - C3H5O(COOH)3
Cloruro de Cobalto - CoCl2 (Catalizador)
NaBH4 + 2 H2O NaBO2 + 4 H2↑
C3H5O(COOH)3 + 2 NaHCO3 + [CoCl2] C3H5O(COONa)3 + 3 CO2 + 3 H2 + [CoCl2]
2 H2 + O2 + [Pd Catalizador] 2 H2O + [Pd Catalizador]
Indicador REDOX
Azul de metileno Ox (Azul) Azul de metileno Red (Incoloro)
Cámara de anaerobiosis
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8

Vol. antibiótico (ml) 1.0 -- -- -- -- -- -- --

Vol. de diluyente (ml) 5.0 9.5 10.0 8.5 14.5 20.0 6.5 7.5

Vol. de transferencia (ml) -- 2.5 2.0 1.5 1.5 1.0 1.0 1.5

Dilución individual 1:6 1:4.8 1:6 1:6.666 1:10.666 1:21 1:7.5 1:6

Dilución acumulada
1:6 1:28.8 1:172.8 1:1151.88 1:12286 1:258006 1:1935045.5 1:11610273.1

Concentración final en tubo(µg/ml) 41666.66 8680.55 1446.75 217.03 20.34 0.968 0.129 0.02

Caja 1:6.666 1 2 3 4 5 6 7 8

Dilución acumulada en placa 1:40 1:191.98 1:1151.88 7678.43 1:81898.47 1:1719867.99 1:12899013.3 1:77394080.48

Concentración final en placa (µg/ml)

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